siRNA沉默Annexin1 基因对膀胱癌T24细胞生物学特性的影响
【摘要】 目的 观察RNA 干扰技术沉默Annexin1基因表达对膀胱癌T24细胞增殖能力的影响。方法 针对Annexin1基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(siRNA),脂质体介导瞬时转染膀胱癌T24细胞，转染后应用半定量RTPCR和Western印迹法检测Annexin1 mRNA和蛋白的改变，透射电镜观察细胞凋亡情况，用MTT法检测沉默Annexin1表达对膀胱癌T24细胞增殖的影响。结果 转染siRNA后膀胱癌T24细胞Annexin1 mRNA和蛋白水平显著下降(P<0.05)，转染siRNA沉默Annexin1基因表达后膀胱癌T24细胞出现典型凋亡细胞，增殖能力显著下降(P<0.05)。结论 RNA 干扰Annexin1基因后其mRNA 和蛋白水平显著下降，诱导了膀胱癌T24细胞凋亡，并且抑制细胞的增殖。
【关键词】 膀胱癌;Annexin1;siRNA
【Abstract】 Objective To explore the effects of Annexin1 gene silencing by small interfering RNA(siRNA) on bladder cancer cells T24 in vitro. Methods Three siRNA targeting three different domains of Annexin1 gene were designed, synthesized, and transfected into bladder cancer T24 cells by lipofectamineTM2000. After transfection, expression of Annexin1 was detected by RTPCR and Western blotting. Transmission electronic microscope(TEM) was applied to observe the apoptosis cellular morphology. The cellular proliferation inhibitory ratio was eva luated by MTT assay. Results Compared with the negative control (siRNANC) groups, transfection of three targeting siRNA in T24 cells decreased the expression of Annexin1 mRNA and protein. Annexin1 gene silencing reduced the proliferative capacity of T24 cells and leaded to tumor cells apoptosis after transfection. Conclusions The chemically synthesized specific siRNA targeting Annexin1 could effectively reduce the expression of Annexin1 gene, reduce the proliferative capacity of T24 cells and induce tumor cells apoptosis.
【Key words】 Bladder cancer; Annexin1; siRNA
膜联蛋白1(Annexin1)增强感染局部的凋亡表明它对肿瘤的诊断和治疗有重要意义，因此该蛋白质与肿瘤细胞的活性调节相关〔1，2〕。目前，Annexin1的表达缺失是否与膀胱癌细胞的异常增殖潜力相关以及对化疗药物的敏感性尚未明了，本研究利用RNA干扰(RNAi)技术通过沉默Annexin1基因直接观察Annexin1表达缺失对膀胱癌细胞体外增殖能力的影响，为进一步揭示该基因促进肿瘤进展的机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 膀胱癌T24细胞株(哈尔滨医科大学附属第四医院中心实验室提供)，RNA干扰试剂盒(SilencerTM siRNA Construction Kit)购自美国Ambion公司。阳离子脂质体转染试剂盒LipofectamineTM2000、Trizol、MMLV购自Invitrogen 生命技术公司。RPMI1640、IMDM、胰蛋白酶购自GIBCO公司。
1.2 小干扰RNA(siRNA)的设计及合成 根据GenBank 中Annexin1基因序列(GenBank Accession No.NM000700)和siRNA设计原则，应用Ambion生物公司的设计软件(siRNA Target Finder and Design Tools)，自Annexin1 mRNA的起始密码子开始，寻找“AA”二连序列，记下其3′端的19个碱基序列作为候选的siRNA靶序列。将候选序列在GenBank中用Blast软件进行同源序列搜索，排除那些和其他基因编码序列或EST同源的候选序列。最终选择了3段21个碱基的siRNA序列(TI、TⅡ、TⅢ)，分别靶向Annexin1基因的240260 (SI) ，435455 (SⅡ)和 506526 (SⅢ)区域(见表1)。另外，根据转染后细胞形态学变化，设计与TI(240siRNA)序列含有同样核苷酸比例的随机对照siRNA(240c1，240c2)做为阴性对照，用Blast验证随机序列与GenBank中其他已知人类基因序列没有同源性。利用针对三磷酸甘油醛脱氢酶(βactin)基因的正、反义寡核苷酸模板作为RNA干扰实验的阳性对照。设计的正反义寡核苷酸模板3′端均加上T7启动子引物5′CCTGTCTC3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 引物的设计与合成 设计1对Annexin1的引物，上游：5′GACCACCTCAACTCAAGGAC3′,下游：5′AGGAAGCTGGATGAAGAGAC3′，长度 546 bp，同时设计1对管家基因βactin引物，上游：5′ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG3′，下游：5′AGAGGTCCTTACGGATGTCAACG3′，长度290 bp，由上海生工合成。
1.4 细胞培养 常规RPMI1640培养，至转染前夜，细胞培养液更换为用无血清和无抗生素的IMDM，置于37℃、 5% CO2孵箱,转染后用20%FBS IMDM培养液,按常规方法培养,取处于对数生长期的细胞用于实验。用OptiMEMⅠ转染液及脂质体LipofectamineTM 2000转染试剂，按试剂盒说明优化转染条件，分别将3对siRNA和阳性对照筛选出的干扰序列的scramble siRNA(siRNAneg)以400 nmol/L的终浓度加入细胞培养液，孵育24、48、72 h后收获细胞进行检测。实验重复3次。表1 靶向Annexin1的siRNA核苷酸序列
1.5 半定量RTPCR检测转染前后膀胱癌T24 细胞Annexin1 mRNA 的表达水平 Trizol试剂盒提取细胞总RNA，用2 μg总RNA进行cDNA的合成，半定量RTPCR方法检测siRNA转染后不同时间点24、48、72 h细胞中Annexin1 mRNA表达水平，βactin作内对照。PCR 扩增条件An
本站论文资源均为来自网络转载，免费提供给广大作者参考，不进行任何赢利，如有版权问题，请联系管理员删除！ 快速论文发表网（www.ksfbw.com）本中心和国内数百家期刊杂志社有良好的合作关系，可以帮客户代发论文投稿.
投稿邮箱：ksfbw@126.com
客服Q Q：
82702382
联系电话：15295038833
本站论文资源均为来自网络转载，免费提供给广大作者参考，不进行任何赢利，如有版权问题，请联系管理员删除！
文章评论
共有 0 位网友发表了评论