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ALOX5AP基因SG13S114T/A多态性与急性心肌梗死的相关性

作者:时间:2011-03-24 15:32:07 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:924次 ]

【摘要】目的：探讨中国苏南地区汉族人群5脂氧合酶激活蛋白(ALOX5AP)基因SG13S114T/A多态性与急性心肌梗死(AMI)的相关性。方法：以300例AMI患者(AMI组)和415例非冠心病患者(对照组)作为研究对象，应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测ALOX5AP基因SG13S114T/A多态性。结果： (1) 与对照组相比，AMI患者TT和AT基因频率均明显升高，且频率分布都有统计学意义(P分别为0.027,0.032);T等位基因频率分布差异无统计学意义(59.50%和64.82%，P=0.324)。(2)亚组分析：男性AMI患者的AA，AT，TT基因型和T等位基因频率均无统计学差异，而女性TT基因型与AMI的发生存在相关性(P=0.042)。对多个危险因素行多元Logistic回归分析显示ALOX5AP基因SG13S114T/A AT和TT基因型与AMI的发生密切相关(P值分别为0.000，0.001)。T等位基因频率具有统计学意义(P=0.038)。AT和TT基因型与男性和女性AMI的发生均存在相关性(男性P值分别为0.010，0.040;女性P值分别为0.010，0.004)，T等位基因与女性AMI的发生也有关联(P=0.026)，而T等位基因与男性AMI的发生无相关性(P=0.285)。结论：在中国苏南地区汉族人群中，ALOX5AP基因SG13S114T/A TT和AT基因型可能是苏南地区汉族人群AMI的易感基因型，T等位基因可能是AMI发病的重要遗传危险因素，并与女性AMI的发病存在相关性。

【关键词】 5脂氧合酶激活蛋白; 基因多态性; 急性心肌梗死

　[Abstract] Objective: To investigate the association between 5lipoxygenase activating protein(ALOX5AP)gene SG13S114T/A polymorphism and acute myocardial infarction(AMI) in the Chinese Han population of Sunan region. Methods: All of 300 patients with AMI and 415 control subjects free from coronary artery disease were recruited into the study. The ALOX5AP SG13S114T/A polymorphism gene was determined by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis(PCRRFLP). Results: (1) Compared with the control group, there was statistical difference of the frequencies of TT and AT genotype in the AMI group (P value was 0.027 and 0.032 respectively); the frequencies of T allele was not significantly different(59.50%vs 64.82%,P=0.324). (2)sub group revealed：The frequencies of AA,AT,TT genotype and the T allele of the SG13S114T/A had no association with AMI in male group, but the frequency of TT genotype had significant correlation with AMI in female. Multivariate logistic regression analysis indicated that there was significantly correlation between ALOX5AP gene SG13S114T/A AT and TT with AMI(P value was 0.000 and 0.001 respectively).T allele had significantly association with AMI(P=0.038). There was statistical difference of the frequencies of AT and TT genotype with AMI in both male and female(P value was 0.010 and 0.040 respectively in male group; P value was 0.010 and 0.004 respectively in female group), T allele was a significant risk factor for AMI in the female carrier (P=0.026), but had no association with AMI in male (P=0.285). Conclusion: The ALOX5AP gene SG13S114T/A polymorphism may be associated with the susceptibility to AMI in the Chinese Han population of Sunan region. The T allele was a significant genetical risk factor for AMI and was the susceptibility to AMI in the female.中医论文发表

　　[Key words] 5lipoxygenase activating protein; gene polymorphism; acute myocardial infarction

　　目前认为急性心肌梗死(AMI)是一种炎症型疾病，与多种环境因素和遗传因素有关。5脂氧合酶激活蛋白(5lipoxygenase activating protein, FLAP)/ 5脂氧合酶(5lipoxygenase, 5LO)通路的一个基因突变体(ALOX5AP)是AMI的敏感因素[1]，ALOX5AP是冠心病或脑卒中发病的一个独立的危险因子，1个ALOX5AP单倍体HapA就可以使冰岛人群患心肌梗死和脑血管病的风险增高2倍[2]，ALOX5AP基因HapB单倍型也可以增加英国人群心肌梗死(MI)的风险性[3]，与德国人心肌梗死的发病率也显著相关[4]，但在瑞典和美国西部人群中ALOX5AP基因与心肌梗死或脑卒中的发生无相关性[5-6]。另外，Zhang等[7]研究表明，ALOX5AP基因SG13S114T/A单核苷酸多态性(SNP)与脑梗死有相关性，但它是否与中国汉族人群AMI发病存在相关性尚未见报道。本研究以苏南地区汉族人群为研究对象，探讨ALOX5AP基因SG13S114T/A多态性与AMI的相关性。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象

　　1.1.1 AMI组

　　2005年6月至2010年5月在江苏大学附属武进医院心内科住院的AMI患者300例，男218例，女82例，年龄31～92(65.38±10.94)岁。诊断均符合2002年AHA/ACC关于AMI的诊断标准。

　　1.1.2 对照组

　　选择同期住院并行冠脉造影排除冠状动脉病变者415例，男211例，女204例，年龄16～86(61.18±11.33)岁。所有研究对象均经本院医学伦理委员会批准，并征得所有入选对象知情同意。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 一般资料采集

　　使用统一表格记录所有入选对象的基本资料，如性别、年龄、吸烟史、高血压史、糖尿病史、家族史、血糖、血脂及冠脉造影等各项结果。

　　1.2.2 基因组DNA的提取

　　抽取外周静脉血2 ml，置入EDTA抗凝管，分离血浆和白细胞，以酚氯仿法提取白细胞DNA，-70 ℃保存。

　　1.2.3 PCR扩增目的基因片段

　　以基因组DNA为模板，体外扩增ALOX5AP基因位于染色体的13q12-13，长度为31 kb DNA片段。PCR引物序列为上海生物技术工程有限公司合成，上游引物为5′GTGTTCAGGAAGGGAGTTTCTGT3′，下游引物为5′GTCTATGGTTGCAACATTGAGATTA3′。PCR反应体系25 μl ：基因组DNA 1 μl，10 pmol上、下游引物各1 μl，Premix EX Taq DNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司)12.5 μl, 去离子水9.5 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min;反应循环：变性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 40 s，共30个循环;最后72 ℃延伸10 min。反应结束后取PCR产物4 μl，2%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙啶)，凝胶成像分析仪分析PCR扩增结果。

　　1.2.4 PCR产物限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析

　　酶切反应体系20 μl，其中10 μl PCR反应产物，缓冲液2 μl，限制性内切酶VspⅠ(TaKaRa)和去离子水7.5 μl，37 ℃温育过夜。酶切产物于3%琼脂糖凝胶电泳35 min，凝胶成像仪判断酶切结果。基因型分为AA(25 bp)纯合型;AT杂合型(212 bp,187 bp和25 bp)和TT纯合型(212 bp)。取部分PCR扩增产物进一步测序鉴定。

　　1.2.5 统计学分析

　　应用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示并采用t检验， ALOX5AP基因型和等位基因频率采用频率计数法计算，研究对象基因型与HardyWeinberg平衡的符合程度和计数资料比较采用χ2检验,关联程度用优势比(odds ratio, OR)和95%可信区间(confidence interval, CI)表示，AMI的多种相关因素分析采用Logistic回归分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 AMI组与对照组的临床资料比较

　　与对照组相比，AMI组年龄较大，男性吸烟者，高血压和糖尿病比例较高，LDL明显增高(表1)。表1 AMI组和对照组一般临床资料比较

　　2.2 基因多态性分型

　　ALOX5AP基因SG13S114T/A多态位点经PCR扩增后获得目的片段大小为212 bp。由于T等位基因不存在VspⅠ内切酶酶切位点，而A等位基因存在该酶切位点，因此PCR扩增产物经内切酶消化后，在琼脂糖凝胶电泳中可以观察到3种基因型：TT纯合型(212 bp)、AT杂合型(212 bp、187 bp和25 bp)和AA纯合型(187 bp和25 bp)(图1)。PCR产物经测序进一步验证(图2)。

　　2.3 基因多态性分析中医论文发表

　　ALOX5AP基因SG13S114T/A单核苷酸多态性(SNP)在AMI组和对照组中均存在AA、AT和TT三种基因型，AMI组和对照组基因型分布经χ2检验均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明入选样本具有群体代表性。与对照组相比，AMI组AT和TT基因型频率明显增高(P值分别为0.032和0.027)。由于AMI组和对照组临床资料不相匹配而对AA、AT和TT三种基因型以及T等位基因行多因素Logistic回归分析，结果显示，ALOX5AP基因SG13S114T/A SNP AT和TT基因型以及T等位基因与AMI的发病密切相关(P分别为0.000、0.001和0.038)。见表2。1：阴性对照;2：AA基因型(187 bp和25 bp);4、6、7：TT基因型(212 bp);3、5、8：AT基因型(212 bp、187 bp和25 bp);9：20 bp 标准参照物。图1 ALOX5AP基因SG13S114T/A PCR产物酶切电泳图图2 ALOX5AP基因SG13S114T/A多态性PCR产物测序图表2 ALOX5AP基因SG13S114T/A多态性AT和TT基因型与AMI的关系

　　2.4 不同性别ALOX5AP基因SG13S114T/A分析

　　男性AMI患者的AA，AT，TT基因型和T等位基因频率均无统计学差异，而女性TT基因型与AMI的发生存在相关性(P=0.042)。在调整吸烟、年龄，BP，TC，TG，HDL，LDL，Glu等危险因素并经Logistic回归分析后，AT和TT基因型与男性和女性AMI的发生均存在相关性(男性P值分别为0.010，0.040;女性为0.010，0.004)，T等位基因与女性AMI的发生也有关联(P=0.026)，而T等位基因与男性AMI的发生无相关性(P=0.285)。见表3。表3 不同性别AMI患者 ALOX5AP基因SG13S114T/A多态性分布

3 讨论

　　ALOX5AP基因是编码FLAP的基因，位于染色体的13q12-13，包含5个外显子、4个内含子，长度为31 kb [8]，其5’侧翼端含有一个TATA box和GRE(glucocorticoid response element)，AP1和AP2(the activation of the transcription factors)转录子的结合位点 [9]，该基因编码区含有多个单核苷酸多态性(SNP)，SNP的突变率较高，推测在这些SNP中可能存在着功能性突变，影响FLAP的合成或影响其活性。5脂氧合酶(5lipoxygenase, 5LO)是白三烯合成过程中的重要酶。白三烯是重要促炎标志物，可以激活白细胞和附着在血管内皮细胞层的单核细胞，增加血管的通透性[10] 。ALOX5AP的突变增加了动脉血管壁白三烯的产生和炎症介质的分泌，从而引发血管炎症和动脉粥样硬化的形成，最终导致管壁狭窄、斑块损坏和破裂。在急性冠脉综合征(ACS)患者中，ALOX5AP水平升高预示患者危险性增加。

　　本研究表明ALOX5AP基因TT、AT基因型与AMI的发病密切相关，与对照组相比，频率显著升高且差异有显著意义，将结果进行Logistic回归分析TT和AT基因型仍具有显著性意义，说明其可能并不独立于血压、血糖、血脂和吸烟等因素之外，是AMI的易感基因，但可能和其他危险因素一起在AMI的发病中起作用。两组T等位基因行多个相关危险因素Logistic分析比较也有相关性，说明ALOX5AP基因SG13S114T/A多态性的T等位基因可能是该研究人群AMI发病的重要遗传危险因子。进一步分析发现，男性AMI患者的AA，AT，TT基因型和T等位基因频率均无统计学差异，而女性TT基因型与AMI的发生存在相关性。但经多因素Logistic回归分析后，AT和TT基因型与男性和女性AMI的发生均存在相关性，T等位基因与女性AMI的发生也有关联，而T等位基因与男性AMI的发生无相关性，提示ALOX5AP基因SG13S114T/A多态性AT，TT基因型和T等位基因与女性AMI的发病更密切相关，不管是否存在影响AMI发病的其他因素，携带该基因型及T等位基因的女性有发生AMI的潜在性。ALOX5AP基因是如何增加AMI的患病风险还不清楚，目前认为这可能是由于ALOX5AP编码的FLAP是炎症介质白三烯产生旁路的一个调节点，是5LO的结合蛋白，受白细胞的限制，并可被各种刺激引发[11]。当FLAP活性增高时，它使5LO的活性也增高，二者活性的改变使白三烯大量分泌，激活白细胞、促进单核细胞和内皮细胞的黏附，增加血管通透性，刺激新生内膜增生，导致动脉粥样硬化，最终导致斑块破裂血栓形成，AMI发生。

　　ALOX5AP基因多态性与AMI相关可能与下列因素有关。ALOX5AP 是编码FLAP的基因，FLAP促进炎性细胞因子的合成，而炎性细胞因子由各种炎症细胞分泌，这些炎症细胞聚集于受损血管壁侧，最终导致动脉粥样硬化形成。因此FLAP被认为是动脉粥样硬化炎症反应的关键调节因子[12]，它与花生四烯酸结合激活5LO途径，5LO使巨噬细胞、树突状细胞、泡沫细胞、杆状细胞和嗜中性粒细胞聚集。当损伤进一步加重时，细胞表达5LO的数量将显著增加，并促进5LO聚积在那些即将破裂的部位，如动脉粥样硬化斑块纤维帽两侧，引起斑块破裂并触发血栓形成，导致冠状动脉管腔完全或不完全闭塞。在FLAP/5LO通路中，5LO通过氧化花生四烯酸生成白三烯B4(LTB4)[13]，其中LTB4是潜在的中性白细胞、巨噬细胞和其他炎性细胞的化学诱导剂[14]，导致动脉粥样硬化和血管管腔狭窄，促使ACS的发生。

　　本研究结果与国外研究结论不尽相同，可能原因为：① 样本量相对较小，对统计学结果会产生一定影响;② 样本的不均一性，如种族、性别和发病年龄;③ 该位点的多态性变异对AMI的作用可能受环境及其他因素的影响。

　　综上所述，ALOX5AP基因SG13S114T/A TT和AT基因型可能是苏南地区汉族人群AMI的易感基因型，T等位基因可能是AMI发病的重要遗传危险因素，并与女性AMI的发病密切相关，但与AMI的确切关系及对其预后和生存率的影响还需多中心、大样本、前瞻性的研究及在功能学方面深入研究。

【参考文献】中医论文发表
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