辣椒连坐土壤中真菌分析
作者:冯征山时间:2016-01-09 10:44:21 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:1228次 ]
【内容摘要】：本实验通过马丁氏培养基进行微生物的培养，以一年生，连作两年，三年辣椒连作土壤为实验对象， 分离纯化其中的真菌并进行了数量统计。结果表明，种植一年，连作二年，三年土壤中真菌数量有明显变动，三年土壤中的真菌数量较一年土壤中的真菌数量有两个到三个数量级的提高。
【关键词】: 辣椒 土壤 真菌
实验目的：分离纯化辣椒连作土壤中的真菌并计数。
实验原理：土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。真菌在土壤中的数量仅次于细菌和放线菌，。分离土壤中的真菌并不难，但由于其菌落大，容易扩展，技术准确性较低。本实验采用加有链霉素（或氯霉素、庆大霉素）和孟加拉红的马丁氏培养基分离土壤中的真菌。在此培养基上，放线菌和细菌被链霉素和孟加拉红所抑制， 但大多数真菌能够生存，且其菌落受孟加拉红的抑制而较小， 从而避免了某些真菌的扩散蔓延而带来的数量上的误差。
实验器材和材料：
（1） 器材：台秤、电子秤、烧杯、试管、移液管、移液枪、无菌培养皿、接种环。
（2）材料：连作辣椒土壤、无菌水、马丁-孟加拉红培养基。
（3）试验方法和步骤：
1 采样
（1）采样地点：酒泉辣椒种植区
（2）采样方法：五点取样法、蛇形取样法
（3）具体步骤：选取辣椒种植一年的土壤，在距其表面5 厘米10 厘米15 厘米20 厘米处进行取样，连作两年、三年的土壤依上述步骤分别进行取样。
2 真菌分离培养基的制备
配方： 葡萄糖10.0g 、蛋白胨5.0g 、琼脂 20g 、K2HPO4 1.0g 、MgSO4 •7 Ｈ 2O 0.5g 、1/3000 孟加拉红水溶液100mL、0.03 ℅ 链霉素稀释液100mL、自来水800mL。
操作步骤：
1） 用搪瓷杯量取自来水500mL 置小铝锅中，在电炉上加热。
2） 按配方分别称取各种药品，加入自来水中，边加边搅拌，然后量取100mL1/3000 孟加拉红水溶液加入。
3） 加入20g 浸洗过的琼脂煮沸至溶化。
4） 总体积定容至900mL，无需调节pH 值。
5） 趁热分装于两个规格为500ml 的锥形瓶中。
6） 高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min，备用。
注意：1） 取国产链霉素1g/ 瓶，用无菌吸管吸入10mL 无菌水溶解，得到10% 链霉素溶液。取0.3mL 该溶液定容于100mL 灭菌容量瓶即可得到0.03% 链霉素溶液。2） 使用前， 将上述培养基熔化冷却至55 ～ 60℃，按每10mL 培养基加入1mL0.03% 链霉素溶液，即可使每毫升培养基含30ug 链霉素。
3 土壤稀释液的制备
分别称取连作1,2,3 年的土样1g 放入盛9mL 无菌水的三角瓶中，振摇约20 分钟，使土与水充分混合，将菌分散。在无菌操作条件下，用无菌移液管吸取lmL 的菌液于一管9mL 无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2 浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-8。最终只取稀释至10-6、10-7、10-8。（在土壤稀释过程中，吸取不同梯度的菌液需换用不同的吸管）
3.1 平板分离
（1）倒平板
将加入链霉素溶液的马丁氏培养基倒平板
（2）涂布 将倒好的平板分成3 份，分别标上1 年、2 年、3 年。将每份培养基分为3 组平板分别标上10-6、10-7、10-8 三种稀释度，然后用三支1mL 无菌吸管分别由10-6、10-7、10-8 三管土壤稀释液中各吸取100ul 对号放于已标好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
（3）恒温培养 将上述接种土壤悬液的平板倒置于28℃培养3-5d。
（4） 挑菌纯化 从长有单菌落的平板中选取典型的真菌菌落转接斜面，并同时制片作纯度检查，若不纯，应进一步挑取该菌落制成菌悬液进一步作稀释分离，直至获得纯培养体为止。
（5）计数 选择每皿出现0 ～ 100 个菌落的平板，计算土壤真菌（包括酵母菌）的含量。选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算：每g 样品的菌数= 同一稀释度几次重复的菌落平均数×10× 稀释倍数
3.2 菌种保存
将分离到的真菌转接到PDA 斜面上培养，待长好后，置于冰籍中保存。
结果分析：
实验数据：实验数据：
菌落计数第一次（表1）
菌落计数第三次（表2）
结果与分析：
在对不同样本的真菌进行计数之后，我们发现连作三年的土壤真菌含量较种植辣椒一年的土壤中真菌的含量有三个数量级的提高，较连作两年的土壤也有一个数量级的提高。
另外查阅相关文献得知种植一年辣椒土壤与普通菜地之间真菌含量的差异不大，可以初步认为是连作是使得土壤由真菌化由细菌化的转化的因素之一。
土壤在对数据分析时我们发现数量变化幅度较为明显的真菌大多为霉菌，因此，我们对霉菌的数量变化又单独做了比较，发现其数量变化幅度基本与真菌变化幅度相一致，从而得连作辣椒土壤中影响土壤类型的真菌主要为霉菌。
【参考文献】：
[1] 中国科学院南京土壤研究所微生物编著. 土壤微生物研究法[M]. 北京: 科学出版社.1985.
[2] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海: 上海科学技术出版社.1979.
[3] 乔宾福主编. 实用微生物技术[M]. 上海: 上海科学出版社, 1993 ：57-60.
[4] 戴芳澜遗著. 真菌的形态和分类[M]. 北京: 科学出版社.1987.
[5] 邵力平等编．真菌分类学[M]．北京：中国林业出版社， 1984.
[6] 菌物学报（原真菌学报、菌物系统）[J]．中国菌物学会和中国科学院微生物研究所主办.
[7] 不同土地利用方式下土壤微生物数量与土壤肥力的关系 章家恩，刘文高，胡刚 华南农业大学热带亚热带生态研究所，广东广州 510642.
【关键词】: 辣椒 土壤 真菌
实验目的：分离纯化辣椒连作土壤中的真菌并计数。
实验原理：土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。真菌在土壤中的数量仅次于细菌和放线菌，。分离土壤中的真菌并不难，但由于其菌落大，容易扩展，技术准确性较低。本实验采用加有链霉素（或氯霉素、庆大霉素）和孟加拉红的马丁氏培养基分离土壤中的真菌。在此培养基上，放线菌和细菌被链霉素和孟加拉红所抑制， 但大多数真菌能够生存，且其菌落受孟加拉红的抑制而较小， 从而避免了某些真菌的扩散蔓延而带来的数量上的误差。
实验器材和材料：
（1） 器材：台秤、电子秤、烧杯、试管、移液管、移液枪、无菌培养皿、接种环。
（2）材料：连作辣椒土壤、无菌水、马丁-孟加拉红培养基。
（3）试验方法和步骤：
1 采样
（1）采样地点：酒泉辣椒种植区
（2）采样方法：五点取样法、蛇形取样法
（3）具体步骤：选取辣椒种植一年的土壤，在距其表面5 厘米10 厘米15 厘米20 厘米处进行取样，连作两年、三年的土壤依上述步骤分别进行取样。
2 真菌分离培养基的制备
配方： 葡萄糖10.0g 、蛋白胨5.0g 、琼脂 20g 、K2HPO4 1.0g 、MgSO4 •7 Ｈ 2O 0.5g 、1/3000 孟加拉红水溶液100mL、0.03 ℅ 链霉素稀释液100mL、自来水800mL。
操作步骤：
1） 用搪瓷杯量取自来水500mL 置小铝锅中，在电炉上加热。
2） 按配方分别称取各种药品，加入自来水中，边加边搅拌，然后量取100mL1/3000 孟加拉红水溶液加入。
3） 加入20g 浸洗过的琼脂煮沸至溶化。
4） 总体积定容至900mL，无需调节pH 值。
5） 趁热分装于两个规格为500ml 的锥形瓶中。
6） 高压蒸汽灭菌，121℃灭菌30min，备用。
注意：1） 取国产链霉素1g/ 瓶，用无菌吸管吸入10mL 无菌水溶解，得到10% 链霉素溶液。取0.3mL 该溶液定容于100mL 灭菌容量瓶即可得到0.03% 链霉素溶液。2） 使用前， 将上述培养基熔化冷却至55 ～ 60℃，按每10mL 培养基加入1mL0.03% 链霉素溶液，即可使每毫升培养基含30ug 链霉素。
3 土壤稀释液的制备
分别称取连作1,2,3 年的土样1g 放入盛9mL 无菌水的三角瓶中，振摇约20 分钟，使土与水充分混合，将菌分散。在无菌操作条件下，用无菌移液管吸取lmL 的菌液于一管9mL 无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2 浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-8。最终只取稀释至10-6、10-7、10-8。（在土壤稀释过程中，吸取不同梯度的菌液需换用不同的吸管）
3.1 平板分离
（1）倒平板
将加入链霉素溶液的马丁氏培养基倒平板
（2）涂布 将倒好的平板分成3 份，分别标上1 年、2 年、3 年。将每份培养基分为3 组平板分别标上10-6、10-7、10-8 三种稀释度，然后用三支1mL 无菌吸管分别由10-6、10-7、10-8 三管土壤稀释液中各吸取100ul 对号放于已标好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
（3）恒温培养 将上述接种土壤悬液的平板倒置于28℃培养3-5d。
（4） 挑菌纯化 从长有单菌落的平板中选取典型的真菌菌落转接斜面，并同时制片作纯度检查，若不纯，应进一步挑取该菌落制成菌悬液进一步作稀释分离，直至获得纯培养体为止。
（5）计数 选择每皿出现0 ～ 100 个菌落的平板，计算土壤真菌（包括酵母菌）的含量。选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算：每g 样品的菌数= 同一稀释度几次重复的菌落平均数×10× 稀释倍数
3.2 菌种保存
将分离到的真菌转接到PDA 斜面上培养，待长好后，置于冰籍中保存。
结果分析：
实验数据：实验数据：
菌落计数第一次（表1）
菌落计数第三次（表2）
结果与分析：
在对不同样本的真菌进行计数之后，我们发现连作三年的土壤真菌含量较种植辣椒一年的土壤中真菌的含量有三个数量级的提高，较连作两年的土壤也有一个数量级的提高。
另外查阅相关文献得知种植一年辣椒土壤与普通菜地之间真菌含量的差异不大，可以初步认为是连作是使得土壤由真菌化由细菌化的转化的因素之一。
土壤在对数据分析时我们发现数量变化幅度较为明显的真菌大多为霉菌，因此，我们对霉菌的数量变化又单独做了比较，发现其数量变化幅度基本与真菌变化幅度相一致，从而得连作辣椒土壤中影响土壤类型的真菌主要为霉菌。
【参考文献】：
[1] 中国科学院南京土壤研究所微生物编著. 土壤微生物研究法[M]. 北京: 科学出版社.1985.
[2] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海: 上海科学技术出版社.1979.
[3] 乔宾福主编. 实用微生物技术[M]. 上海: 上海科学出版社, 1993 ：57-60.
[4] 戴芳澜遗著. 真菌的形态和分类[M]. 北京: 科学出版社.1987.
[5] 邵力平等编．真菌分类学[M]．北京：中国林业出版社， 1984.
[6] 菌物学报（原真菌学报、菌物系统）[J]．中国菌物学会和中国科学院微生物研究所主办.
[7] 不同土地利用方式下土壤微生物数量与土壤肥力的关系 章家恩，刘文高，胡刚 华南农业大学热带亚热带生态研究所，广东广州 510642.
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