霍奇金淋巴瘤化疗前后血清蛋白指纹图谱的变化
【摘要】 目的： 探讨霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)患者化疗前后血清蛋白指纹图谱变化，以寻找与其疗效有关的血清蛋白生物标记。方法： 应用表面增强激光解析离子飞行时间质谱技术(SELDITOFMS)检测18例初诊和16例化疗后HL患者血清，并取21例正常对照的血清，用CM10蛋白芯片获得血清蛋白表达指纹图谱，用Biomarker Wizard3.1软件对检测数据进行统计学分析。结果： 化疗前后HL患者差异表达31个蛋白质M/Z，其中有25个蛋白质在化疗后HL血清高表达，有6个蛋白质低表达;化疗后HL和正常对照存在3个没有统计差异的蛋白质。结论： 应用SELDITOFMS可筛选HL患者血清中的标志蛋白，可为HL患者诊断、分期、多药耐药性检测、疗效判断以及早期复发预测等方面提供客观有用的信息。
【关键词】 表面增强激光解析离子飞行时间质谱技术; 霍奇金淋巴瘤; 化疗; 蛋白指纹图谱
[Abstract] Objective: To explore the serum proteome profiles changes of preand postchemotherapy Hodgkin lymphoma patients, and to search the serum biomarkers for the therapeutic effect of HL. Methods： Surfaceenhanced lastexdesorption/ionizationtime of flightmass spectra (SELDITOFMS) was used to detect the sera of 34 HL patients and 21 control cases, 18 newly diagnosised patients and 16 postchemotherapy patients. The Biomarker Wizard 3.1 system software was applied to analyze the data from the serum protein mass spectra by CM10 proteinchip array. Results： Thirtyone protein mass peaks were found differently expressed between the sera of newly diagnosised and postchemotherapy HL patients. Twentyfive proteins were upregulated and six downregulated in sera of postchemotherapy HL cases. Thirty proteins are found no differently expressed between the sera of postchemotherapy HL patients and control ones. Conclusion： SELDITOFMS may be used to screen the serum biomarkers of HL and might provide objective useful information for diagnosising, staging, detecting MRD, and to judge therapeutic effect, and predict earlier relapse of HL.
[Key words] SELDITOFMS; Hodgkin lymphoma; chemotherapy; proteome profiles
表面增强激光解析离子飞行时间质谱技术(SELDITOFMS)是一种新的可高通量检测蛋白质的技术，其芯片表面可结合特异的蛋白质。该技术应用范围广，如探讨细胞凋亡机制[1]，肿瘤的早期诊断、疗效检测、复发早期预警及患者预后评估，发病机制的探讨等，并且在血液系统疾病中有了一定应用[2]。本实验应用该技术对霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)患者化疗前后血清中差异表达蛋白质进行分析，以寻找与HL疗效有关的差异表达蛋白质。教师评职称论文发表
1 材料与方法
1.1 病 例
34例HL患者血清标本均来自2006年11月至2008年5月泸州医学院血液科和肿瘤科住院患者，并经过组织病例活检和免疫组织化学染色确诊，年龄15～75岁，其中初诊病例18例，男10例，女8例;化疗后病例16例(ABVD方案化疗大于或等于4次)，男9例，女7例，完全缓解12例，部分缓解4例。正常对照21例为门诊体检者，男14例，女7例，年龄12～76岁。
1.2 主要试剂与仪器
乙腈、尿素(Urea)、三氟乙酸(TFA)、芥子酸(SPA)、TrisHCI pH 9.0、3环己胺1丙磺酸(CHAPS)、NaAc、PBS缓冲液(×10)、HPLC H2O、1N HCl等均购自美国Sigma公司。PBSⅡ/C型蛋白质指纹图谱仪、CM10(弱阳离子交换表面)蛋白芯片由美国Ciphergen公司生产。
1.3 方 法
1.3.1 收集标本
抽清晨空腹静脉血2～3 ml，置于BD真空管内(不抗凝)，半小时内放入4℃冰箱静置1 h，3 000 r/min短暂离心，取上清液加入Eppendof管内;再4 ℃ 3 000 r/min离心5 min，0.25 ml Eppendof管编号、分装，30 μl每管，每个样本至少分装5管，放入-80 ℃冰箱保存备用。
1.3.2 制备样品混合液
取96孔细胞培养板放冰盒上，每孔加入10 μl U9(9 mol/L Urea，2% CHAPS，1% DTT)，置于冰盒表面。取出冻存的血清标本，置于冰上溶解后4 ℃ 10 000 r/min离心2 min，将分离的血清加入上述含10 μl U9的细胞培养板孔，每孔5 μl，4 ℃环境中600 r/min振荡30 min。每孔加入185 μl结合缓冲液(50 mmol/L NaAc，pH 4.0)，立即置于4 ℃环境中600 r/min振荡2 min混匀。
1.3.3 上样及洗脱
将CM10芯片装入Bioproeessor中，记下芯片号，用排枪加200 μl 150 mmol/L pH 4.0 NaAc，在层析柜中600 r/min振荡5 min，拍干，重复一次。待30 min后用排枪快速加入185 μl NaAc(总量计200 μl)于96孔板，垂直用力打出，不碰底，不吹吸，层析柜中600 r/min振荡2 min左右混匀。用排枪加100 μl处理好的样本到芯片上，快速加，用手轻拍加样板以去除气泡，还有气泡的用枪头吹吸，用密封条密封后，层析柜中600 r/min 4 ℃振荡1 h，甩掉样本，用力拍干。用排枪加200 μl NaAc，600 r/min 常温下5 min，甩掉，用力拍干，重复3次。快速加HPLC水200 μl，甩掉，用力拍干，重复2次取出芯片，放置晾干后加半饱和SPA 1 μl，5 min后再加1 μl，晾干后即可上机检测。
1.4 采集数据
利用PBS Ⅱ/C型蛋白质指纹图谱仪对结合在CM10芯片表面的血清蛋白质进行检测，设定最高检测相对分子质量为100 000，优化范围为2 000～20 000，激光强度210，检测敏感度为9。仪器采用Ciphergen公司提供的allinone标准分子质量蛋白质进行校正，系统的质量偏差≤0.1%。采用Ciphergen Proteinchip软件自动采集实验数据并进行降低基线和均一化处理。
1.5 统计学处理
利用Ciphergen Proteinchip软件对获得的混合对照血清图谱进行分析并计算其差异性，以变异系数(CV)值表示，设定CV<15%时，不同芯片之间的实验误差为可接受范围。采用Biomarker Wizard 3.1软件对实验数据进行聚类分析和统计学处理，设定有意义的蛋白质峰出现频率阈值为10%，进行2次信噪比(S/N)过滤。确定两组间蛋白质峰值比较时，对初步筛选的蛋白质峰进行t检验，P<0.05的蛋白质峰认为差异具有统计学意义。教师评职称论文发表
2 结 果
通过SELDITOFMS质谱仪对结合在蛋白质芯片上的血清标本蛋白质进行检测，获得34例霍奇金淋巴瘤患者和21例正常对照血清蛋白质指纹图谱(图1)。比较分析18例初诊HL和16例化疗后HL患者的血清蛋白质指纹图谱，发现两组间差异表达31个蛋白质M/Z，其中有25个蛋白质在化疗后HL血清高表达，有6个蛋白质低表达(表1，图2)。16例化疗后HL与21例正常对照的蛋白质峰相对比，发现5个M/Z相同的蛋白质，通过统计学分析发现M/Z为2 053、2 091和4 158蛋白质与正常对照比较差异无统计学意义(表2)。图1 霍奇金淋巴瘤患者血清蛋白指纹图谱表1 初诊和化疗后HL患者血清蛋白质峰值图2 初诊和化疗后霍奇金淋巴瘤患者差异血清蛋白质峰直方图表2 化疗后患者和正常对照血清蛋白质峰
3 讨 论
霍奇金淋巴瘤是一种淋巴细胞和(或)组织细胞恶性增殖性疾病。有资料显示HL的发病受社会经济状况影响[3]。HL分期主要采用Ann Arbor分期方案，疗效标准采用1989年英国Cotswold会议的报告，但均有很大的主观性。凌家瑜等[4]认为应用SELDITOFMS分析，可在化疗前后筛选出非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者血清中的标志蛋白，有可能在微小残留病检测、早期复发预测、疗效判断等方面提供有用的信息。Zhang等[5]应用该技术发现M/Z为10 197.91的蛋白质在NHL血清中显著升高，并且在不同的国际预后指数(IPI)评分或乳酸脱氢酶水平患者间也有差异，认为有可能是检测NHL治疗反应和评价预后的新的血清学生物标记。
本实验发现化疗前后HL血清蛋白质指纹图谱之间有31个差异蛋白质峰，其中25个蛋白质在化疗后HL血清中高表达，6个蛋白质低表达，我们认为化疗后高表达的蛋白可能是正常细胞所表达，化疗前被淋巴瘤细胞抑制，而低表达的蛋白可能是淋巴瘤细胞所表达，化疗后低表达与化疗药物应用后瘤细胞负荷减少有关，它们可能是HL疗效观察和多药耐药性(MRD)的血清标志物。25个高表达的蛋白质中，14个M/Z在2 000～5 000，9个在5 000～10 000，2个大于10 000;6个低表达的蛋白质中M/Z大于10 000的有2个，小于10 000的有4个，可见与化疗有关的血清蛋白质可能主要是中小分子质量蛋白质或多肽。同时我们发现M/Z为2 053，2 091和4 158的蛋白质与正常对照没有统计学差异，可能是对化疗最敏感的血清蛋白质标志物中的3个。通过http://us.expasy.org/tools/tagident.html在蛋白质数据库中搜索发现，31个差异蛋白质峰中，M/Z为11 449和8 183蛋白质峰对应的蛋白质分别是生长蛋白抑制因子3和线粒体基因组必须蛋白2类似物。生长蛋白抑制因子3由p47ING3基因编码，是ING基因家族成员。Nagashima等[6]研究发现生长蛋白抑制因子3在包括脾脏、睾丸、骨骼肌和心脏在内的一些正常人类组织和器官中有较高表达水平，在不同癌细胞系有不同的表达水平。他们认为p47ING3基因调节p53介导的转录、细胞周期调控和凋亡。线粒体基因组必须蛋白2是缺乏线粒体基因组细胞生长的必须蛋白，分子功能尚不明确，而蛋白MGR2同系物属于MGR2家族，位于生物膜上的单次穿膜蛋白，其功能可能与MGR2相似。但两种蛋白质均需要进一步证实。
本研究结果表明，应用SELDITOFMS可筛选HL患者血清中的标志蛋白，可能在HL患者诊断、分期、MRD检测、疗效判断、早期复发预测等方面提供有价值的信息。
【参考文献】
[1] 申卫红，刘 慧，彭 鑫，等.强力霉素抑制丝裂霉素诱导的MTEC1细胞凋亡及其蛋白质组初步分析[J].江苏大学学报：医学版，2009，19(3)：197-201.
[2] 周靖泳，韩丽英.表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术在血液系统疾病中的应用[J].医学综述，2007，13(24)：1941-1943.
[3] Clarke CA, Glaser SL, Keegan TH, et al. Neighborhood socioeconomic status and Hodgkin′s lymphoma incidence in Califormia[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2005，14(6)：1441-1447.
[4] 凌家瑜，孙晓非，张 星，等.非霍奇金淋巴瘤患者化疗前后血清蛋白质谱动态变化及其标志蛋白的筛选[J].癌症，2008，27(10)：1065-1069.
[5] Zhang MZ, Sun ZC, Fu XR，et al. Analysis of serum proteome profiles of nonHodgkin lymphoma for biomarker identification[J]. J Proteomics，2009，72(6)：952-959.
[6] Nagashima M, Shiseki M, Pedeux RM, et al. A novel PHDfinger motif protein, p47ING3, modulates p53mediated transcription, cell cycle control, and apoptosis[J]. Oncogene, 2003, 22(3)：343-350.教师评职称论文发表
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