Claudin-2在大肠癌中的表达及其与临床病理特征的关系

【摘要】  目的 观察紧密连接蛋白 Claudin-2在大肠癌组织中的表达及其与大肠癌发生和发展的关系。方法 运用免疫组化技术检测Claudin-2在大肠癌及癌旁组织、正常组织中的表达，并分析Claudin-2蛋白表达与大肠癌临床各病理特征的关系。结果 Claudin-2在大肠癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织及正常组织(P<0.05)。Claudin-2在大肠癌组织中的阳性表达与肿瘤的分化程度、Dukes分期密切相关(P<0.05)。结论 大肠癌与癌旁组织及正常组织相比，Claudin-2表达阳性率明显升高，其改变在大肠癌的发生发展中可能起重要作用。

【关键词】  紧密连接蛋白;大肠癌;免疫组织化学

　大肠癌是临床上最常见的消化道恶性肿瘤之一，严重地威胁着人类的健康。大肠癌的发病率男女均处于恶性肿瘤的第 3 位，其中在西方发达国家，大肠癌的发病率处于第 2 位[1-2]，在我国病死率列癌症死因的第5位[3]。目前，大肠癌的病因和发病机制尚无明确定论，因此从分子水平研究大肠癌的发病机制，寻找与大肠癌发生、发展密切相关的致病因素，以达到早期预防、早期诊断、早期治疗的目的，提高5年生存率具有重要的现实意义。

　　紧密连接是细胞之间主要的黏附形式之一，对维持机体内环境的稳定，保持上皮细胞的极性，调节细胞的运动、增殖、分化，以及细胞功能的发挥均起重要作用。近年已证实claudins蛋白是构成紧密连接的主要骨架蛋白[4]，其异常表达可能在多种疾病的发病过程中起重要作用。目前研究较多的有claudin-1,-3,-4,-7和-16等，对于Claudin-2却鲜有报道。我们应用免疫组化技术对大肠癌、癌旁及正常组织中Claudin-2进行检测，观察其在大肠癌组织中的表达。

　　1 材料与方法工程师论文发表

　　1.1 临床资料 选自宁夏医科大学附属医院2008年11月-2009年6月间，经病理证实为大肠癌的手术标本35例。其中，男19例，女16例，年龄25～82岁。高分化腺癌9例，中分化腺癌16例，低分化腺癌10例。Dukes分期：A期3例，B期12例，C期16例，D期4例。肠管离体后立即取材，每例标本癌组织取1块，癌旁组织(距肿瘤切缘外3 cm)1块，正常组织(距肿瘤10cm以上)1块。各约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小。全部病例术前均未行放、化疗，临床病例资料完整。

　　1.2 试剂与仪器 一抗：鼠抗人claudin抗体(Zymed公司，美国);S-P免疫组化染色试剂盒(即用型免疫组化ElivisionTMplus广谱试剂盒)购自福州迈新生物技术公司;PBS液(pH7.4);95%乙醇;10%PLL;石蜡切片机(LEICAKM2245切片机，德国);脱水机(LEICAKM300，德国);Nikon eclipse E800显微镜(日本产)。

　　1.3 免疫组化 标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，5mm连续切片，常规脱蜡、水化，用常规S-P法进行免疫组织染色，分别检测Claudin-2在大肠癌组织、癌旁组织和正常大肠组织中的表达。一抗为鼠抗人Claudin-2抗体，严格依照试剂盒使用说明操作。

　　1.4 免疫组化阳性结果的判定 所有石蜡切片由两名病理科医师独立评判后综合评定。Claudin-2蛋白阳性反应为在细胞浆呈棕黄色颗粒。评分标准：阳性细胞数<25%时记为(-)，26%～50%为(+)，51%～75%为(++)，>75%为(+++)。

　　1.5 统计学方法 采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Claudin-2在大肠癌组织、癌旁组织及正常组织中阳性表达的免疫组化结果

　　免疫组化染色结果显示，大肠癌组织中Claudin-2阳性染色为棕黄色，主要定位于细胞浆中。Claudin -2在大肠癌组织、癌旁组织及正常组织中的阳性表达率分别为68.57%(24/35)、42.86% (15/35)和25.71% (9/35)，见图1-6(封4)。Claudin-2在大肠癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织和正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。表1 Claudin-2在大肠癌、癌旁组织及正常组织中的表达

　　2.2 大肠癌组织中Claudin-2表达与大肠癌临床病理特征的关系

　　大肠癌组织中Claudin-2阳性表达率在患者年龄、性别、肿瘤大小分组中的差异均无统计学意义(P>0.05);在不同的Dukes分期和分化程度分组中Claudin-2的阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。表2 大肠癌组织中Claudin-2表达与临床病理特征之间的关系

　3 讨论

　　肿瘤的发生、发展是一个由多基因参与和受多因素影响的复杂过程，目前普遍认为细胞间的黏附力减弱或丧失可导致细胞间连接的破坏，并与肿瘤的浸润转移密切相关[5]。细胞间的黏附形式主要有以下几种：紧密连接(TJs)、缝隙连接和黏附连接等。现已证明，紧密连接是肠上皮细胞间主要的连接方式，并有多种蛋白质参与其形成，包括闭锁(occludin)蛋白、Claudins蛋白、zo-na occludens(ZOs)蛋白以及连接黏附分子(JAM)等。

　　Claudins蛋白是一种相对分子量约为17×103～27×103的跨膜蛋白，目前，已发现至少有24种异构体[6]。Claudins蛋白主要分布于脑、皮肤、神经系统和内脏组织中，其表达有组织特异性，大部分组织中表达两种以上的Claudins，并且在不同组织中Claudins的成员蛋白是不同的。它的功能主要是组成紧密连接的通透屏障，调控离子、大分子和细胞穿过旁细胞途径的通透性。

　　我们应用免疫组织化学技术检测了Claudin-2在大肠癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达，结果显示Claudin-2在大肠癌组织中的阳性表达率为68.57%，较癌旁组织和正常组织中的阳性表达率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，表明Claudin-2在大肠癌组织中表达上调。近来研究显示，Claudins在许多肿瘤中表达异常，Montgomery等[7]利用免疫组化发现Claudin-3、4、7在胃腺癌、食管癌及胃黏膜分化不良细胞、Barrett’s食管中表达较正常组织增高。Kominsky等[8]证实了Claudin-3、4在乳腺癌中均呈高表达。然而，也有研究显示Claudins在某些部位肿瘤组织中的表达是下调或不表达的。比如， Soini[9]通过免疫组化发现， Claudin-2在前列腺癌、乳腺癌中，Claudin-3在肾癌、膀胱癌中的表达均是下调的。Claudin-7在乳腺浸润癌中的表达缺失[10]。但claudins蛋白在恶性肿瘤组织中的表达无论高或低，最终总会引起紧密连接的正常结构破坏，从而引起细胞间分子异常侧向扩散、细胞极性消失等一系列变化，导致更多的营养物质和其他因子供肿瘤生长。因此，Claudin-2在大肠癌组织中的高表达可能与大肠癌的发生发展有关。工程师论文发表

　　在本次研究中，我们还分析了Claudin-2蛋白的表达与大肠癌各临床病理特征的关系，结果表明Claudin-2蛋白在不同Dukes分期、分化程度的大肠癌组织中的表达差异有统计学意义(P<0.05);Dukes分期越晚、分化程度越低，Claudin-2的阳性表达率越高。表明随着肿瘤的进展Claudin-2在大肠癌组织的表达会增强。由此推测，Claudin-2在大肠癌组织中的高表达可能导致大肠黏膜相邻肠上皮细胞间连接的完整性破坏，紧密连接完整性破坏可能是肿瘤侵袭和转移的一个重要步骤。

　　综上所述，Claudin-2在大肠癌组织中呈高表达，其表达异常可能与人大肠癌的发生发展及侵袭转移密切相关，但确切的发病机制仍有待于进一步研究。

【参考文献】
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　　[7] Montgomery E, Mamelak AJ, Gibson M, et al. Overexpression of claudin proteins in esophageal adenocarcinoma and its precursor lesions[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2006,14:24-33.

　　[8] Kominsky SL, Vali M, Korz D, et al. Clostridium perfringens enterotoxin elicits rapid and specific cytolysis of breast carcinoma cells mediated through tight junction proteins claudin 3 and 4[J]. Am J Pathol, 2004,164:1627-1633.

　　[9] Soini Y. Expression of claudins 1,2,3,4,5 and 7 in various types of tumours[J]. Histopathology,2005, 46: 551-560.

　　[10] Kominsky SL, Argani P, Korz D, et al. Loss of the tight junction protein claudin27 correlates with histological grade in both ductal carcinoma in situ and invasive ductal carcinoma of the breast[ J ]. Oncogene, 2003, 22 (13) : 2021.工程师论文发表