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细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定

作者:时间:2011-02-11 10:19:47 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:839次 ]

【摘要】　　目的：构建细粒棘球绦虫（E.g.）成虫全长cDNA质粒文库，并检测文库质量。方法:提取E.g.成虫mRNA，应用SMART方法构建pBluescript II SK全长cDNA质粒文库，检测文库的重组率及容量；用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增，检测插入片段大小。随机挑选阳性重组克隆5′端测序，归并unigene，计算unigene得率，全长性判定主要根据同源全长基因5'末端进行比较判定并计算全长率。结果:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库。文库的重组率为95.04%，库容量1.13×106；平均插入片段长度约为1.2kb。24个随机阳性克隆测序，unigene比例为69.57%，全长性比率为64.71％。结论:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库，文库质量良好。

【关键词】细粒棘球绦虫；成虫；全长cDNA质粒文库；构建；鉴定

　　［ABSTRACT］ Objective: To construct and eva luate fullLength cDNA library of adult Echinococcus granulosus（E.g.）. Methods:mRNA was extracted from the adult E.g. and used for the construction of fulllength cDNA library using SMARTpBluescriptⅡSK kit. The recombination rate and capability of the library was measured and the length of insert fraction of the positive recombinant clones was tested by PCR. Positive recombinant clones were randomly selected for 5'end sequencing and the rates of unigene, fulllength cDNA was analyzed by EST data using bioinformatics. Results: The fulllength cDNA libray of adult E.g. was constructed successfully.The recombination rate and capability of the library were 95.04% and 1.13×106, respectively.The average length of insert fraction was about 1.2kb. 24 recombinant clones randomly selected were sequenced, the rate of unigene and fulllength cDNA were 69.57% and 64.71%. Conclusions: A highquality of fulllength cDNA plasmid library of adult E.g. has been constructed successfully.科学论文发表

　　［KEY WORDS］ Echinococcus granulosus;Adult; Fulllength cDNA plasmid library; Construction; eva luation

　　细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus，E.g.）成虫寄生于犬科动物小肠，其中绦期幼虫细粒棘球蚴（包虫，echinococcus cyst/hydatid cyst）寄生在中间宿主偶蹄类家畜（羊、牛、马等）及人的多种器官、组织内，引起以占位性病变为主要临床表现的囊型包虫病（cystic echinococcosis，CE），是一种严重危害人类健康和畜牧业生产的人畜共患寄生虫病。CE分布于世界许多国家的牧区，我国是CE的主要流行区之一，主要分布于西北牧区。CE是我国乃至世界一个重要的公共卫生及经济问题［1］，已被列入我国十一五重大寄生虫病防治项目。疫苗及早期诊断是其防治的关键，目前尚无成熟的疫苗及诊断试剂。该虫的基因组学及功能基因组学尚未开展，已知基因甚少，不利于对相关基础问题的研究，更不利于相关疫苗、诊断试剂及药物的研究。

　　本研究目的在于通过构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库并对文库质量进行鉴定，为大规模表达序列标签（expressed sequence tag，EST）测序，开展基因表达谱分析，克隆和鉴定一批功能基因全长cDNA序列，并为开展重要基因的功能研究打下基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　E.g.成虫标本采自青海省西宁市人工感染犬小肠，用灭菌生理盐水漂洗3次后液氮冻存。试剂：Trizol 总RNA提取试剂盒、1 kb DNA 梯度标记物为GIBCO BRL公司产品；SMART IV 寡核苷酸，CDS III/3JPCR 引物，pBluescript II SK的改造载体（将EcoR I和Not I之间的序列改造为Sfi I A和Sfi I B接头序列），由上海联合基因公司合成和提供；DH5α感受态菌，通用合成引物M13+/M13，异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）和xgal为上海生工生物工程技术有限公司产品；质粒抽提试剂盒，荷兰QIAGEN公司产品；DYEnamicTM ET DYE Terminator Kit（MegaBACETM）为美国Amersham Biosciences产品；MilliQ水纯化系统，美国Millipore公司产品；SpectraMax Plus384连续波长酶标仪，美国Molecular Devices公司产品；FR280电泳仪，上海复日公司产品；HYBAID PCR EXPRESS PCR仪，英国Thermo Hybaid公司产品；ABI PRISM 3700测序仪，美国PE ABI公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 全长cDNA质粒文库的构建

　　1.2.1.1 样品总RNA抽提及mRNA纯化

　　按提取试剂盒操作说明书抽提总RNA产物，于260nm及280nm测吸光度（A260及A280），计算A260/A280比值判定纯度（纯RNA A260/ A280=1.9-2.1），1.1%琼脂糖电泳检测RNA完整性。

　　根据QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits操作说明书进行分离，A260及A280检测及1.1%琼脂糖电泳检测抽提结果。

　　1.2.1.2 cDNA第一链合成

　　0.5mL灭菌离心管中加入以下试剂： 2μg 样品 RNA，1μL SMART IV Oligonucleotide，1 μLCDS III/3' PCR Primer，加水补足5μL，混匀试剂并稍离心，72℃温浴2min，冰浴2min，稍离心后加入下列试剂：2.0μL 5×FirstStrand Buffer，1.0μL DTT (20mmol/L)，1.0μL dNTP Mix (10mmol/L)，1.0μL PowerScript Reverse Transcriptase，总反应体系

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