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乙型肝炎病毒X基因对肝癌细胞Bel7404细胞周期的影响

作者:时间:2011-02-10 14:37:27 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:898次 ]

【摘要】目的：构建转基因细胞株Bel7404/HBx,研究HBx对肝癌细胞周期及凋亡的影响，为探索HBx与原发性肝细胞癌（HCC）之间的关系提供更为完善的理论依据。方法：运用脂质体转染及G418筛选获取Bel7404/HBx阳性克隆，并分别用聚合酶链反应（RTPCR）和Westernblot鉴定HBx mRNA与蛋白的表达，进一步用四唑兰比色实验（MTT）检测Bel7404/HBx的增殖，流式细胞仪（FCM）检测Bel7404/HBx的细胞周期及凋亡。结果：成功构建Bel7404/HBx，MTT检测结果表明Bel7404 /HBx生长速度加快，流式细胞仪检测结果显示,与对照组细胞相比, Bel7404 /HBx凋亡率明显降低（P<0.05)，G1期细胞比例降低（P<0.05), S期及G2期细胞所占比例增高（P<0.05)。结论:HBx能加速细胞周期进程，从而促进肝癌细胞的生长并抑制细胞凋亡，可能对肝癌细胞恶性程度具有重要的影响。

【关键词】 HBx；原发性肝细胞癌；聚合酶链反应；免疫印迹；四唑兰比色实验；流式细胞术

［ABSTRACT］ Objective: To establish transgenic cell lines Bel7404/HBx, study the influence of HBx on cell cycles and apoptosis, and provide more extensive theories for exploring the relationship between HBx and hepatocellular carcinoma (HCC). Methods: The Bel7404/HBx positive clones were obtained by Lipofectamine tranfection and G418 selection, then HBx mRNA and protein were detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR) and Western blot, respectively. The tetrazolium blue colorimetric test (MTT) and flow cytometer ( FCM) were used to measure proliferation, cell cycles and apoptosis of Bel 7404/HBx. Results: Bel7404/HBx was successfully established. MTT showed that the Bel7404 / HBx grew faster than the control group （P<0.05), and FCM showed that compared with cells in control group, the apotosis rates of Bel7404/HBx were at a low level, cells in G1 phase decreased but increased in S and G2 phase in proportion（P<0.05). Conclusions: HBx can accelerate cell cycle progression to promote the growth of hepatoma cells but inhibit apoptosis, which indicates that it may have great influence on the malignant degree of hepatocellular carcinoma.

［KEY WORDS］ HBx; Hepatocellular carcinoma; RTPCR; Western blot; MTT; FCM

原发性肝细胞癌(HCC)一直以来是危害人民身心健康的一大疾病，其发病机理多种多样，其中HBV在其发病中一直占据重要的地位。目前研究证实，HBV中最小的阅读框X基因在HCC发生中所起的作用至关重要，但各家研究结论不太一致，有的结论甚至互为矛盾，这也使得HBx致癌机理尚未研究清楚。因而，HBx致HCC机理仍然是目前研究的热点，为此，我们以重组质粒pcDNA3.1 (＋) /v5hisBHBx作为载体，通过脂质体转染将X基因导入肝癌细胞Bel7404细胞系中，用G418筛选获取稳定表达HBx蛋白的阳性克隆，并观察HBx对肝癌细胞Bel7404增殖、凋亡及细胞周期的影响，为进一步探索HBx与HCC之间的关系提供更为完善的理论依据，希望能为肝细胞癌的预防、诊断及治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料体育论文发表

Effectene Transfection Reagent（Qiagen）；G418（Promega）；各种限制性核酸内切酶、聚合酶等（Takara）；鼠单克隆抗体（ABCam）；羊抗鼠IgG(晶美)；DMEM 、MTT及PI(sigma)。重组质粒 pcDNA3.1（＋）/v5hisBHBx由上海第二军医大学遗传研究所何晓文教授惠赠；DH5α由西班牙Navarra大学癌症基因研究所钱程教授提供；Bel7404细胞由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所刘新垣院士惠赠。扩增HBx基因片段上游引物为：5′ CGGAATTCCGATGGCTGCTAGGCTGTG3′,命名为P1,下游引物为：5′CCCTCGAGGGTGCATGGTGCTGGTGA3′,命名为P2，扩增目的片段为445bp,PCR引物合成及测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 Bel7404细胞的转染与筛选重组质粒 pcDNA3.1（＋）/v5hisBHBx经酶切、PCR及测序鉴定后按Effectene Transfection Reagent说明书进行转染操作，48h后用含500mg/L G418的选择培养基筛选阳性克隆。筛选至对照组细胞全部死亡后实验组存活的细胞即为阳性克隆，挑取克隆扩大培养并将G418浓度减至250mg/L维持筛选，以获得稳定表达HBx的转基因细胞株（Bel7404/HBx）。实验设空白对照组（Bel7404细胞）与空载体对照组（转染pcDNA3.1的Bel7404细胞，Bel7404/ pcDNA3.1）。以下所设对照组与此相同。

1.2.2 转基因细胞株Bel7404/HBx的鉴定采用聚合酶链反应（RTPCR）检测HBx mRNA的表达: TRIzol一步法提取各组细胞总RNA（按试剂盒说明书操作），经逆转录生成cDNA，取2μL cDNA作模板，以上述引物扩增HBx基因片段，条件如下：94℃预变性10min，94℃变性45s，52℃退火1min，72℃延伸1min，扩增30个循环，2%琼脂糖凝胶电泳后成像观察。Western blot检测HBx 蛋白的表达:各组细胞培养48h后置冰上PBS洗涤2次，加入冰预

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