Apoptin原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

【摘要】  　　目的 构建Apoptin的原核表达载体，并制备抗原物质Apoptin融合蛋白。方法 在获得Apoptin融合基因的基础上，成功构建了Apoptin的高效原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin，将该质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体菌中，以IPTG对其进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果 转化有Apoptin的原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后，经SDS-PAGE分析，在相对分子质量约17 000的位置出现目的蛋白条带，大小与Apoptin融合蛋白一致。结论 Apoptin原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin能够表达出Apoptin融合蛋白，为进一步的Apoptin研究和制备Apoptin抗体奠定了基础。

【关键词】  Apoptin 原核表达载体 pET-28a(+) 大肠杆菌

　　ABSTRACT: Objective  To construct an Apoptin prokaryotic vector, aiming to produce antigenic fusion protein Apoptin. Methods  The Apoptin gene was amplified from the template of plasmid pSSCHG/NT4-Apoptin- HA2-TAT by PCR. The Apoptin was sub-cloned into the multiple clone sites of plasmid pET-28a (+) to get the prokaryotic vector of pET-28a (+)-Apoptin, which was transformed into E.coli BL21 (DE3). Expression of E.coli BL21 (DE3) was induced by IPTG. The specific protein expression was detected by SDS-PAGE. Results  The fusion protein was expressed with high efficiency in E.coli BL21 (DE3) transformed by pET-28a (+)-Apoptin after induction with IPTG. The specific fusion protein had an apparent related molecular weight of about 17 000 ku as indicated by SDA-PAGE analysis. Conclusion  The Apoptin prokaryotic expression vector with pET-28a (+)-Apoptin can effectively express Apoptin fusion protein, laying a foundation for further study of Apoptin and preparation of antibodies against Apoptin.

　　KEY WORDS: Apoptin; prokaryotic expression vector; pET-28a (+); E.coli

　　目的基因或载体对正常组织的毒性和肿瘤细胞对治疗的耐受等是限制肿瘤基因治疗临床应用的瓶颈。Apoptin(凋亡素)的发现突破了上述瓶颈，给抗肿瘤的基因治疗带来了转机。Apoptin是鸡贫血病毒(chicken anemia virus, CAV)的vp3基因编码的蛋白质，体外合成或基因工程表达的Apoptin能特异的引起多种人源性恶性肿瘤细胞凋亡，对正常二倍体体细胞无作用；且这种选择性凋亡作用既不依赖于p53的介导，也不被bcl-2过表达所抑制［1］，显示其可能在肿瘤基因治疗中具有迷人的应用前景。本实验在获得CAV Apoptin基因的基础上，构建Apoptin的原核表达载体(图1)，为下一步表达特异性蛋白产物、制备Apoptin抗体奠定基础［2］。

　　1  材料与方法护理论文发表

　　1.1  质粒、菌株、工具酶及试剂
 
　　含Apoptin全基因组序列的体外克隆NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒由本课题组构建［2］；大肠杆菌Top10、大肠杆菌BL21均来自西安华广生物工程公司；质粒pGEM-T Easy购自Promega公司；质粒pET-28a(+)购自Novegen公司；限制性内切酶、Taq聚合酶购自华美生物公司；T4 DNA 连接酶购自MBI公司；主要试剂为国产或进口分析纯。

　　1.2  引物的设计和合成

　　根据前期研究的Apoptin基因序列的结果［2］，按照载体上正确的插入方向和译读框架设计一对引物。引物的5′端分别添加了限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切序列。扩增的片段包括Apoptin完整的基因序列。上游引物：5′-GGAATTCATGAACGCTCTCCAAGAAG-3′；下游引物：5′-GCTCGAGTCACAGTCTTATACGCCTTCTTG-3′(下划线处分别为EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切序列)，由上海生工生物工程公司负责合成，用PAGE纯化。

　　1.3  目的基因的扩增和纯化

　　以含有Apoptin全基因组序列的pSSCHG/NT4-Apoptin-HA2-TAT为模板，上下游引物各50 pmol，10×PCR反应缓冲液10 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，加超净水至终体积为49 μL。94 ℃预变性5 min、94 ℃变性1 min、50 ℃退火1 min后，再加入1 μL Taq DNA聚合酶。进行94 ℃变性1 min、50 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min 30个循环，72 ℃继续延伸5 min。经酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，70%(体积分数)乙醇洗涤沉淀后用30 μL TE充分溶解沉淀。取少量PCR产物进行10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，并在紫外线测定A260值对产物进行定量。

　　1.4  重组质粒pGEM-T Easy/Apoptin(pT/Apoptin)的构建与鉴定 教育教学论文发表

　　取上述PCR产物600 ng(0.2 g/L)、质粒pGEM-T Easy 25 ng(50 g/L)、T4DNA连接酶5 u(5 u/μL)、10×T4 DNA连接酶缓冲液2.5 μL以及去离子水18 μL(总体积25 μL)建立连接反应体系，23 ℃水浴1h。取10 μL连接产物转化100 μL感受态大肠杆菌Top10，涂布LB(Amp+)平皿，37 ℃倒置过夜。从LB平皿中挑选单菌落用碱裂解法，经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳，筛选出正确重组质粒进行大量制备。对含有目的基因的重组质粒进行DNA测序(上海生工生物工程公司)。

　　1.5  重组质粒pET-28a(+)-Apoptin的构建和鉴定

　　将测序正确的重组质粒pGEM-T Easy/Apoptin、pET-28a(+)分别进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，各取1 μL酶切产物、1 μLT4DNA连接酶、10×T4DNA连接酶缓冲液2.5 μL、去离子水18.5 μL(总体积25 μL)，16 ℃水浴过夜。取10 μL连接产物转化100 μL感受态大肠杆菌