TNFα、Leptin-Rb、NF-κB和PPAR-γ在酒精性肝病大鼠肝细胞中的表达

【摘要】  　　目的 探讨TNFα、NF-κB、Leptin-Rb和PPAR-γ等在大鼠酒精性肝病中与肝组织炎症、坏死和纤维化的关系。方法 胃造瘘法建立长期大鼠酒精性肝病模型，分别在第4、8、12、24和52周用免疫组化、原位杂交和RT-PCR技术检测不同阶段大鼠肝组织中TNFα、NF-κB、PPAR-γ和Leptin-Rb等的表达。结果 TNFα、NF-κB和Leptin-Rb水平在模型组大鼠肝细胞中，第8周表达逐渐增强，第24周起高水平表达一直持续至52周(P<0.01)。PPAR-γ在对照组和第4、8周模型组肝细胞中表达最强，第12周表达开始减弱。TNFα和NF-κB在肝细胞中的表达呈明显正相关关系，与PPAR-γ则呈负相关关系(P<0.01)。结论 TNFα和NF-κB与肝细胞病变程度有很好的一致性关系,Leptin-Rb在肝细胞的表达与肝纤维化发展相一致，PPAR-γ则刚好相反。

【关键词】  酒精性肝病 细胞因子 大鼠

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the expressions of TNFα, NF-κB, leptin-Rb and PPAR-γ mRNA in liver tissues of rats with alcoholic fatty liver to identify the relationship between these factors and liver inflammation, necrosis and fibrosis. Methods  Long-time rat model groups (gastric cannulation ethanol infusion models of ALD) were made. At the end of 4th, 8th, 12th, 24th and 52th week, the expressions of TNFα, NF-κB and PPAR-γ protein and mRNA in rat liver tissues were observed with immunohistochemical method and in situ hybridization. Reverse transcription polymerase chain reaction was performed to determine the expression of Leptin-Rb mRNA. Results  The expressions of TNFα, NF-κB and leptin-Rb in rat alcoholic fatty liver enhanced gradually from week 8. Strong positive expression lasted from week 24 to week 52. The expression of PPAR-γ was strongly positive in control group and in 4th and 8th week model groups (P<0.01). The expression weakened from week 12. The expression of TNFα in liver tissues was positively correlated with that of NF-κB significantly and negatively correlated with that of PPAR-γ. Conclusion  TNFα and NF-κB were strongly positively correlated with the liver inflammation and necrosis. The expression of leptin-Rb increased in hepatocytes, which induced hepatic fibrosis in rats. The expression of PPAR-γ increased in the initial period and lowered in the later time.

　　KEY WORDS: alcoholic fatty liver; cytokine; rats

　　肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNFα)是一种早期反应的细胞因子，在损伤初期即开始诱导其他促炎及抗炎递质的表达增加或减少，使体内炎症反应失衡。核转录因子(nuclear factor κappa B, NF-κB)是TNFα炎症级联反应中的重要启动因子，在肝脂肪变和纤维化的发生发展中起着重要作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ, PPAR-γ)参与多种炎性介质合成及分泌的调节，特别是在脂肪细胞分化、糖脂代谢调节和胰岛素抵抗中起重要作用。瘦素(leptin)参与肝脏糖及脂肪的代谢调节，使甘油三酯合成增加，肝糖原产生减少［1］。但是，目前对它们在酒精性肝病发病过程中的作用还不明确，有待做大量的研究工作才能得到验证。国内在这方面的研究还很少。本实验拟对TNFα、NF-κB、Leptin-Rb和PPAR-γ等在大鼠酒精性肝病不同阶段肝组织中的表达进行检测，研究它们之间的相互关系及其在肝组织脂肪变、炎症坏死和肝纤维化的发生、发展过程中的作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验仪器与试剂 职称论文发表期刊

　　梯度PCR仪 9700(美国Gene Amp公司)，自动凝胶扫描成像分析系统(美国 Wealtec公司)，紫外可见分光光度仪(美国Amersham Biosciences公司)；大鼠TNFα mRNA原位杂交试剂盒，大鼠NF-κB P65 mRNA原位杂交试剂盒，兔抗大鼠PPAR-γ多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，RT-PCR一步法试剂盒(TaKaRa 宝生物工程有限公司)，总RNA提取试剂盒(清华天为时代生物工程有限公司)，PCR引物(上海生工生物技术有限公司)。鲎试剂偶氮显色法测定内毒素(上海市临床检验中心试剂盒)。

　　1.2  实验方法

　　普通清洁级健康雄性成年SD大鼠80只，体重150-200 g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。饲养于西安兵器工业521医院卫生研究所实验动物中心。动物房通风良好，温度保持在20-27 ℃。经胃造瘘管灌酒制作酒精肝实验动物模型，并设实验对照组，具体方法同文献报道［2］。造模成功后分别于第4、8、12、24周及52周，在各实验组和对照组中随机取8只大鼠，硫喷妥钠30 mg/kg体重腹腔注射麻醉，心包腔无菌穿刺采血处死，常规分离血清，测肝功、甘油三酯(triglyceride, TG)和总胆固醇(total cholesterol, TCh)及血糖(blood glucose, GLU)。另取1 mL血置于肝素化去致热原试管中，分离血清送第四军医大学临床检验中心测定内毒素含量。取肝组织制成石蜡切片常规HE染色，肝组织病理学观察。同时用免疫组化和原位杂交试剂盒分别检测肝组织中PPAR-γ，TNFα mRNA和NF-κB P65 mRNA，方法按试剂盒使用说明书稍加改进。肝组织中Leptin-Rb的检测用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)一步法，常规抽提肝组织RNA后，按试剂盒使用说明书配制RT-PCR反应液总量50 μL，按以下条件