掺锶磷酸钙骨水泥的体外细胞生物学性能评价及其与掺锶量的相关性

【摘要】  　　目的 评价“SrHPO4/Ca4(PO4)2O/CaHPO4”系掺锶磷灰石骨水泥的生物相容性及其与掺锶量的关系。方法 通过急性全身毒性、热原性、溶血性、体外细胞毒性以及成骨细胞在材料表面的黏附、增殖与表达等实验，检测材料的性能及生物降解潜能。结果 “SrHPO4/Ca4(PO4)2O/CaHPO4”系掺锶磷灰石骨水泥的急性全身毒性、热原性、溶血性、体外细胞毒性均为合格。Sr-CPC的热原性、溶血性以及碱性磷酸酶值与掺锶量呈非线性关系。结论 含锶磷酸钙骨水泥体外细胞生物相容性良好，是安全的新型骨组织工程支架材料。

【关键词】  掺锶磷灰石骨水泥 生物相容性 成骨细胞 成纤维细胞

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the biocompatibility of Sr-containing calcium phosphate cement series ［SrHPO4/Ca4(PO4)2O/CaHPO4］. Methods  A series tests, including acute systemic toxicity test, pyrogen test, hemolysis test, cytotoxicity test and in vitro biological behavior of osteoblasts, were designed to eva luate the cytobiology of the material. Results  Sr-containing calcium phosphate cement had excellent biocompatibility and all of the biological eva luation tests were up to the standard. Pyrogen test, hemolysis test and ALP value of Sr-containing calcium phosphate cement behavior had non-linear relationships with the Sr-doped content. Conclusion  Sr-containing calcium phosphate cement series are good in biocompatibility and can be widely used in tissue engineering research.

　　KEY WORDS: Sr-containing calcium phosphate cement; biocompatibility; osteoblast; fibroblast

　　羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)块体陶瓷虽然具有良好的生物相容性与生物活性，但降解极其缓慢［1］。While等［1］报道HAP植入体内后年降解率不高于10%。为了改善其降解性，人们做了大量研究工作，认为通过在HAP人工骨结构中建造宏观孔洞［2-3］，降低钙/磷元素比率［4］， HAP晶格引入碳酸根等［5-6］方法可以改善这类材料的降解性。然而，这些方法对其抗压强度不利或者无积极作用。

　　近年来的大量研究表明，锶取代钙掺入磷灰石后对其性能产生重要影响，不仅改善了生物相容性［7］、生物活性［8］、骨传导性［7］，还协同提高了其降解速率［9-10］与力学性能［11-12］。此外，低剂量Sr还具有促进骨形成、抑制骨吸收［13］、治疗骨癌与骨痛等［14］生物学效能。最近，国内西安交通大学［10-11, 15］发明了由磷酸氢锶(SrHPO4)、磷酸四钙(Ca4(PO4)2O)、磷酸氢钙(CaHPO4)组成的掺锶磷灰石骨水泥(Sr-containing calcium phosphate cement, Sr-CPC)，并对其微观结构、理化性能等方面进行了系统深入的研究。作为合作研究，本文系统考察了Sr-CPC水化产物的急性全身毒性、热原性、溶血性、体外细胞毒性以及成骨细胞在材料表面的黏附、增殖与表达等一系列体外细胞生物学性能，并探讨了掺锶量对这些性能的影响规律，为今后材料的进一步改进并应用于医学领域奠定基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料 经济学论文发表

　　本实验试样是Sr-CPC水化产物，为白色粉末(过100目ASTM筛)，由西安交通大学金属材料强度国家重点实验室提供，固化前的初始原料与配方见表1，制备方法见文献［11］。各试样测试前采用紫外线照射灭菌3 h备用。表1  植入材料的编号与相应成分（略）

　　1.2  急性全身毒性实验

　　随机取ICR品系小白鼠12只，体重18-21 g，雌雄各半,均分为实验组和对照组。将每组材料各3.0 g加入生理盐水30 mL，37 ℃浸提4 h后，经0.22 μm微孔滤膜过滤，制成100 g/L浸提液。无菌条件下分别向实验组和对照组的小鼠腹腔内以每克体重0.1mL剂量注射浸提液或生理盐水，14 d内观察2组小鼠一般状况和死亡情况，第14天脱椎处死，解剖观察2组小鼠各主要脏器的变化。

　　1.3  溶血实验教育类论文发表

　　实验用新西兰白兔1只，体重2.4 kg。心脏穿刺抽取兔血2 mL，立即加入20 g/L的草酸钾生理盐水溶液0.1 mL，混合抗凝。取新鲜抗凝兔全血2 mL，加入2.5 mL生理盐水，稀释备用。

　　每次分别称取灭菌备用的Sr-CPC0、Sr-CPC1、Sr-CPC2粉末0.5 g，共5次，各自加入盛有4 mL生理盐水的15个试管中，编号后作为实验组；阳性对照组为5个空试管内各加入1 g/L碳酸钠溶液4 mL。各试管在37 ℃水浴1 h后，分别加入1 mL抗凝兔血，轻摇。37 ℃水浴3 h后，以1 000 r/min速度离心5 min，取上清液，置入比色皿中，用分光光度计在540 nm波长处测其光吸收度，计算材料溶血率。溶血率计算方法：

　　 溶血率=A实验材料-A阴性对照A阳性对照-A阴性对照

　　1.4  热原实验

　　健康成年新西兰白兔9只，体重1.7-3.1 kg，雌兔无孕，预测体温进行筛选。

　　采用预试检查合格的生理盐水注射液为浸提介质，按材料3.0 g与生理盐水30 mL的比例制取浸提液。

　　实验用兔在实验前1-2 d处于同一环境中，实验室和饲养室温差不大于5 ℃，一次实验全过程室温变化不大于5 ℃。测定家兔正常体温时，将家兔装于固定器内，防止骚动，30 min后开始第1次测温。将肛门体温计插入兔肛门，深度约6 cm，每兔的测温时间至少2 min。符合要求后15 min内，耳缘静脉缓慢注入材料浸提液，剂量为10 mL/kg，浸提液温度为38 ℃，注射完毕每隔1 h测温1次，共测3次，以3次体温中最高1次减去正常体温，即为该兔体温升高度数，根据标准对结果进行评定。

　　1.5  体外细胞毒性评价

　　选用传代48-72 h生长旺盛的L-929细胞系(小鼠成纤维细胞，第四军医大学口腔生物学教研室提供)。DMEM-BFS培养液培养，待细胞长满培养皿后，2.5 g/L胰蛋白酶消化单层培养细胞，使用培养液中止消化，稀释，然后将细胞按浓度1×104/mL接种到96孔板中，每孔重复5遍，共接种细胞悬液200 μL。

　　浸提介质为新鲜配制的DMEM-BFS培养液，pH=7.2。将三组试样粉末分别与浸提介质按1 g/10 mL比例配制