外源基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

作者:梁莲华时间:2016-01-20 16:40:11  来源:www.ksfbw.com  阅读次数:370次 ]
【内容摘要】:外源基因在大肠杆菌中的表达具有复杂性, 不同的外源基因、不同的表达系统会产生完全不同的表达产物状态。通过基因重组可将外源基因导人细胞,并使之进行扩增或表达。在生命科学的研究中,基因重组已经不仅是研究的目的,而且日益成为一项重要的研究手段,所以有着不可替代的地位。本文将通过最基本的流程进行重组操作,目的是使外源基因在大肠杆菌中进行表达。
【关键词】: 外源基因 大肠杆菌 表达 鉴定
大肠杆菌是迄今为止研究得最详尽、应用最广泛的原核生物种类之一,也是基因工程研究和应用中最完善和成熟的受体系统。与其他系统相比,大肠杆菌受体系统具有以下优点:①遗传背景清楚,其K-12MGl655 株大于4000kb 的染色体DNA 已测序,全基因组共含有4405 个开放阅读框,其中大部分基因的生物功能已被鉴定。②培养周期短。③目标基因表达水平高。④代谢途径和基因表达调控机制比较清楚。⑤已有大量可供选择利用的表达载体。这些优点使大肠杆菌在许多的科学研究及应用开发中成为蛋白质表达的首选受体,缺点是大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工及蛋白质折叠系统,得到的蛋白质产物可能缺乏某些天然蛋白质所具有的活性,另外大肠杆菌也难以胞外分泌表达。
1 外源基因在大肠杆菌中的表达内涵
基因在原核细胞中的表达主要包括两个过程:DNA 转录成mRNA 和mRNA 翻译成蛋白质。与真核细胞相比,原核细胞作为表达系统有以下特点:①原核生物只有一种RNA 聚合酶( 真核细胞有三种) 识别原核细胞的启动子。②原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是由若干功能相关的结构基因及其调控区组成的,是基因表达的协同单位。调控区主要包括0 区、启动子及其他有调控功能的部位。③由于原核生物无核膜,所以转录与翻译是偶联的,也是连续进行的。DNA 转录成mRNA 后,mRNA 直接在胞浆中与核糖体结合翻译成蛋白质,事实上, 当mRNA 的合成还没有完成时,蛋白质翻译就开始了。④原核基因一般不含有内含子,在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因此含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成mRNA 前体后,其中的内含子不能被切除。⑤在大肠杆菌mRNA 的核糖体结合位点上,含有与16S rRNA 3’末端碱基互补的序列,即SD 序列,而真核基因则缺乏此序列。⑥原核生物基因表达的调控主要在转录水平,而真核生物基因表达调控除有转录水平外,还有DNA 水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平等多级水平的调节。
根据上述特点,要使外源基因在大肠杆菌中表达,从表达载体来说,除了包括复制子、多克隆位点、选择标记基因等克隆载体必要的元件之外,还必须构建合适的启动子、终止子和SD 序列等调控区,从受体细胞来说,必须能人工调控外源基因的表达,当细胞生长到一定浓度时,才进行诱导表达,防止外源基因产物过早表达对细胞的毒害,同时还要尽可能降低内源蛋白酶对产物的降解。载体和受体相互适应,才能实现外源基因的高效表达及产物在宿主中良好的稳定性,目前已经成功发展了许多表达载体和相应的大肠杆菌宿主菌。
2 外源基因在大肠杆菌中表达的形式
外源基因在大肠杆菌中的表达产物可能存在于细胞的不同位置,如细胞质、细胞周质及细胞外培养基中,外源蛋白以可溶性形式或不溶性包涵体形式存在,根据表达的蛋白质有无外加序列,外源蛋白又有融合型表达与非融合型表达之分。
2.1 包涵体形式的表达
在一定条件下,外源基因的表达产物在细胞内积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构,这种结构称为包涵体。包涵体主要存在于细胞质中,在某些条件下也能在细胞周质中形成。
包涵体大小为0.1 ~ 1μm,无定形,具有很高的密度( 约1.3mg/ mL),呈非水溶性。包涵体主要由蛋白质组成,并且大部分蛋白质为外源基因的表达产物,也含有宿主细胞本身的一些其他表达产物如RNA 聚合酶、核糖核蛋白体、外膜蛋白等。包涵体具有正确的氨基酸序列,但因其空间构象错误,故一般没有生物学活性。由于包涵体中的蛋白质组分大都失去了天然的空间构象,且所有的分子紧密积聚成颗粒状,因此在水溶液中很难溶解,只有在高浓度的变性剂如盐酸胍和尿素等溶液中才能形成均相。
2.2 胞内可溶性表达
某些蛋白质的折叠复性很困难或者不可能,进行胞内可溶性表达是更好的选择。有多种方法可以提高外源蛋白的活性表达比例,减少包涵体的生成。
优化培养条件多种蛋白质在23 ~ 30℃诱导时能够得到活性,而在37℃诱导表达则不行。降低培养温度已成为实现蛋白质活性表达的共识,常用来表达可溶性蛋白。在较低培养温度下, 蛋白质合成速率减慢,其自身聚集趋势减弱,从而有利于蛋白质产物正确折叠。这点来看,构建表达载体时使用中等强度或较弱的启动子,或者虽是强启动子,但受有限的诱导,也有利于蛋白质可溶性表达。另外,改变培养液的pH 或加入山梨醇及甜菜碱等物质,能使宿主菌发生渗透压应激,均可能增加可溶性蛋白比例,减少包涵体生成。
2.3 外源蛋白的融合型表达
融合表达一般是将外源基因引入某表达载体编码的高表达蛋白( 融合头) 序列的3’末端,使融合头序列和外源基因在同一阅读框架下表达,所表达的蛋白质称为融合蛋白。融合头序列通常是大肠杆菌的一段序列,也可以是其他在大肠杆菌中高效表达的基因,编码的可能是整个功能蛋白或蛋白质的一部分,如β 一半乳糖苷酶融合蛋白、谷胱甘肽S- 转移酶(GST) 融合蛋白和硫氧还蛋白(TrxA) 融合蛋白等。
2.4 外源蛋白的分泌型表达
分泌型表达是指蛋白质以带N 端信号肽的前体形式在细胞质中合成,然后再穿膜运送号肽被酶切除。将外源基因置于适合的信号肽序列下游可能实现分泌型表达。
外源蛋白的分泌型表达有许多优点:①信号肽被切除后的蛋白质N 端氨基酸残基与天然蛋白质是一致的,避免了表达时N 端附加的甲硫氨酸对蛋白质活性可能产生的影响。②周质空间中的蛋白酶活力比细胞质中低,使外源蛋白能更稳定地存在于周质中,例如,重组人胰岛素原合成后若分泌到细胞周质中,其稳定性大约是在细胞质中的10 倍。③周质中只有少量的细菌蛋白质,约占细菌总蛋白质4%,使产物纯化相对简单,分泌到培养基中则更易分离纯化。④不同于细胞质,周质空间提供了一个氧化环境,更有利于二硫键的正确形成。
3 外源基因在大肠杆菌中高效表达的策略
3.1 组装强启动子和终止子
不同启动子起始效率不同,理想的启动子应该具有起始转录作用强、受严紧调控、诱导方式简便廉价等特点。因此,在构建大肠杆菌表达载体时一般选用强启动子及可调控的诱导型启动子,但有时为了促进目标蛋白可溶性表达、减少包涵体生成,也会选用中等强度或较弱的启动子。另一方面的要求是启动子的位置,因为启动子与外源基因转录起始位点之间的距离会影响基因的转录效率,在大肠杆菌中,一般为6—9 对碱基。若将目标基因插在一个较强启动子下游,却检测不到相应的mRNA,就要考虑调整启动子和基因之间的距离。
3.2 减少外源基因稀有密码子对表达的影响
无论是原核生物还是真核生物,基因中对编码同一个氨基酸的简并密码子的使用都不是随机的,而是表现出对特定密码子使用的偏爱性,偏爱使用的密码子对应的tRNA 丰度较高,而那些稀有密码子对应的tRNA 丰度则较低。基因呈现的密码子偏爱性越强,其蛋白质合成速率越快,因此表达量大的基因,密码子偏爱性高于表达量低的基因,这也是生物调节基因表达的共同策略之一,不同的是,原核生物和真核生物对简并密码子具有不同的偏爱性,这样,真核生物尤其是哺乳动物的基因在大肠杆菌中表达时会出现大肠杆菌稀少使用的密码子,从而严重影响其表达效率。
有两种策略使稀有密码子含量较高的外源基因在大肠杆菌中获得高表达:一是在大肠杆菌中共表达稀有密码子的tRNA 基因,以提高稀有密码子tRNA 在大肠杆菌中的丰度;二是在不改变外源基因编码蛋白一级结构的前提下,按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律,通过基因全合成或基因定点突变的方法,将外源基因中的稀有密码子更换为大肠杆菌中的偏爱密码子。
3.3 提高外源基因表达产物的稳定性
蛋白质降解作用在生物细胞中普遍存在,细胞内蛋白质降解可以降低代谢途径中酶的存量、灭活某些细胞调控因子、清除代谢中产生的错误折叠蛋白质或其他形式的结构异常蛋白质, 从而实现细胞正常的代谢平衡,因而细胞内的蛋白质降解具有重要的生物学功能。细胞内蛋白质降解作用具有显著的选择性, 表现为细胞存在复杂的蛋白酶系统和蛋白质修饰系统,通过特异性识别作用,细胞完成对靶蛋白的选择性降解。
4 结论
总之,由于待表达的外源基因结构具有多样性,尤其是真核基因与宿主大肠杆菌基因存在着明显差异,要使目标基因在大肠杆菌中获得高效表达并制备出相应的活性产物,还需要根据每一个基因的情况,结合采用的载体- 受体系统加以分析,制定出适当的高效表达策略。
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