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RNAi沉默PRL1基因对肺癌细胞侵袭能力的影响

作者:时间:2011-03-25 14:01:00 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:1050次 ]

【摘要】　　目的：探讨RNA干扰(RNA interference，RNAi)沉默促肝细胞再生磷酸酶 1(phosphatase of regenerating liver cell1，PRL1)基因对肺癌细胞侵袭力的影响。方法：应用PRL1 基因小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染处理肺癌A549细胞后，分别采用实时定量RTPCR和蛋白质印迹检测PRL1基因mRNA和蛋白水平，分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力。结果：与对照组比较，siRNA转染组PRL1 mRNA和蛋白水平明显下调，且呈浓度和时间依赖性（P<0.05，P<0.05）。体外试验发现，PRL1 siRNA可有效抑制肺癌细胞集落生长和侵袭能力，且与浓度相关（P<0.05，P<0.05）。结论： PRL1基因在肺癌侵袭中起着重要的作用，采用PRL1 siRNA转染可抑制肺癌细胞侵袭。

【关键词】肺肿瘤；促肝细胞再生磷酸酶1；侵袭； RNA干扰；小干扰RNA

　　［Abstract］Objective: To study the effects and mechanism of phosphatase of regenerating liver cell1（PRL1）small interfering RNA（siRNA）on invasion of human lung cancer cell.Methods： After lung cancer cell line A549 were transfected by PRL1 siRNA, the mRNA and protein of PRL1 were determined by real time RTPCR and western blot assay,respectively.The anchorageindependent growth was exmined by clon formation in soft agar,and invasion ability was eva luated by boyden chamber model. Results： The siRNA could downregulate the level of mRNA and protein of PRL1 in a dose and time dependent manner. Suppression of of PRL1 expression can inhibit invasion ability and anchorageindependent growth in dosedependent manners（P<0.05, P<0.05）. Conclusion： PRL1 gene might play an important role in development of human lung cancer, and downregulation by PRL1 siRNA could inhibit invasion of human lung cancer cell.

　　［Key words］lung carcinoma； phosphatase of regenerating liver cell1； invasion；RNA interference； small interfering RNA

蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosinephosphatase,PTP)在蛋白磷酸化和去磷酸化平衡中起着重要的作用。促肝再生磷酸酶(phosphatase of regenerating liver,PRLs)是PTP酶家族重要成员之一，该基因家族包括PRL1，PRL2，PRL3 三个成员,它们分别定位在6q12,1p35,8q24.3染色体上,彼此之间的同源性高达76%～85%［1，2］。

　　许多实验研究发现，PRLs分子能导致细胞的恶性转化并且增强肿瘤细胞的增殖、移动、浸润和转移能力［3-10］。但目前对PRL1基因在肺癌细胞侵袭中的研究甚少。本研究借助于RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术，以合成的PRL1基因小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染处理肺癌A549细胞，观察了PRL1 siRNA转染对癌细胞侵袭力的影响。护理论文发表

1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人肺癌A549细胞，购自上海生命科学院。PRL1 siRNA序列（5′GAUGCAGUUCAGUUUAUAATT3′和5′UUAUAAACUGAACUGCAUCTT3′），由美国Dharmacon公司合成。PRL1抗体购自Santa Cruz公司。Trizol，RNase抑制剂，逆转录酶SSRTⅡ，Taq酶和转染试剂Oligofectamine购自美国Invitrogen公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养及转染处理

　　肺癌A549细胞在含10％胎牛血清的RBMI 1640培养液、37℃、5％CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。转染前1天，将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板，1 ml/孔，培养过夜。次日进行转染。基本操作按说明书进行。细胞分组：（1）空白对照组（ConA）：未经任何处理的肺癌细胞；（2）空载对照组（ConB）：即脂质体对照组；（3）错配对照组（ConC）；（4）siRNA组：10％胎牛血清的RBMI 1640中含不同浓度（3.125，6.25，12.5 nmol/L）的已用脂质体包埋的siRNA。转染后于不同时间采用胰酶消化收取细胞，进行以下试验。

　　1.2.2 肺癌细胞PRL1基因检测

　　1.2.2.1 mRNA水平

　　采用荧光实时定量RTPCR检测。收集细胞，以Trizol抽提细胞总RNA, 取总RNA 1 μg，以Oligo dT（15 mer）为引物逆转录合成cDNA第一链，以此cDNA链2 μl为模板进行PCR扩增，步骤参照说明书进行。PRL1定量PCR引物：上游5′ATGGCTCGAATGAACCGCCCAG3′；下游5′TTATTGAATGCAACAGTTGTTT3′。以3磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)为内参。PCR反应条件为：95℃，预变性3 min，95℃，30 s；52℃，45 s；72℃，45 s。35 个循环后，72℃再延伸7 min。

　　1.2.2.2 蛋白水平

　　采用蛋白质印迹方法检测。提取对照组和各实验组细胞总蛋白，蛋白定量后进行常规蛋白质印迹检测。利用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software （Eastman Kodak Company，USA)测定蛋白质印迹条带净灰度值，并与内参照β 肌动蛋白的测定结果相比较，计算其比值。

　　1.2.3 软琼脂集落形成试验

　　参照文献［11］方法，进行软琼脂集落培养试验，观测PRL1 siRNA对肺癌细胞锚着不依赖性增殖的影响。

　　1.2.4 体外侵袭试验

　　参照文献［12］方法，在Boyden小室模型中进行观察。400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力。随机计数5个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3份样本。

　　1.3 统计学方法

　　数据资料以±s表示，用SPSS 10.0统计学软件进行处理。组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义，以P<0.01为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 siRNA敲除对肺癌细胞PRL1基因的影响

经实时定量PCR和蛋白质印迹检测PRL1基因mRNA和蛋白水平，结果显示，与对照组细胞比较，siRNA组PRL1 mRNA和蛋白水平明显降低（P<0.05，P<0.05）(图1，图2）。

　　2.2 PLR1 siRNA转染对癌细胞软琼脂集落形成的影响

    软琼脂集落形成试验结果显示，肺癌A549细胞在体外半固体培养体系中可以自发地形成集落，而经PRL1 siRNA转染的细胞集落生长呈剂量依赖性减少(P<0.05）。
　2.3 PRL1 siRNA转染对肺癌细胞侵袭的影响
    Boyden小室上室细胞穿过膜上matrigel到膜的下室面，其数量反映了细胞侵袭能力的大小。收集转染48 h的细胞，采用Boyden小室模型检测癌细胞侵袭情况。结果发现，与对照组比较，siRNA组穿过滤膜的细胞数明显下降，且与浓度相关(P<0.05）。护理论文发表

　　3 讨论

RNAi是近年来发现的一种调节mRNA的生物学现象，能使基因的mRNA被相应的双链RNA分子剔除，其效果要远强于正义和反义RNA［13］。RNAi最主要的功能在于可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。而siRNA是指RNAi过程中在细胞内产生的长约21～25核苷酸(nt)的小双链RNA分子，是RNAi作用机制的重要中间效应分子。而且已有人工化学合成的siRNA，具有明显的剔除相应基因mRNA的效果［10,13-16］。由于siRNA具有高效剔除基因表达的工具，已被广大科学工作者用作研究基因功能和基因治疗的工具。

在PRLs家族中，PRL1是第1个被发现的基因，它是在鼠的3T3成纤维细胞中作为肝再生早期反应的基因被发现的。研究发现，转染了PRL1的小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞增殖明显增强［3］，提示PRL1基因可促进某些癌细胞增殖。但PRL1在肺癌细胞中作用尚不清楚。

    为了解PRL1基因在肺癌细胞侵袭中的作用，本研究根据PRL1基因mRNA特点，设计siRNA序列，并用化学方法合成siRNA，转染肺癌A549细胞后，分别采用荧光实时定量RTPCR和蛋白质印迹方法检测PRL1基因mRNA和蛋白水平，结果发现，转染组细胞PRL1基因mRNA和蛋白水平明显下降，提示PRL1 siRNA转染成功。

　　接着，我们从体外观察了PRL1基因 siRNA转染对肺癌A549细胞侵袭的影响。

　　正常真核细胞，除成熟血细胞外，大多需黏附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称为锚着依赖性（anchorage dependence）。肿瘤细胞可以锚着不依赖性状态生长。肿瘤细胞在软琼脂形成集落的多少与恶性程度呈正相关。软琼脂集落培养试验结果显示，经PRL1 siRNA转染处理的肺癌细胞软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性。

Boyden小室模型或Transwell是检测癌细胞侵袭试验的经典模型，已被广泛应用于探讨癌细胞侵袭的相关研究中。本研究将经PRL1 siRNA转染处理的肺癌549细胞置于Boyden小室模型中，结果显示，转染组肺癌细胞穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性，提示PRL1下调可抑制肺癌细胞的侵袭能力。

本研究提示，PRL1基因在肺癌细胞侵袭中起着重要的作用，以siRNA转染下调可明显抑制肺癌细胞的侵袭能力，其内在机制尚需进一步深入研究。

【参考文献】
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