【摘要】 目的： 初步探讨人类β1，3半乳糖基转移酶7（β3GalT7）基因对HL60细胞的细胞周期、侵袭能力等方面的影响。方法： 通过脂质体介导将本实验室构建好的β3GalT7真核正义表达载体pEGFPC1T7Sense和反义表达载体pEGFPC1T7AntiSense转染入HL60细胞；流式细胞仪分析各细胞株的细胞周期改变；Transwell侵袭实验检测β3GalT7对HL60细胞侵袭转移能力的影响。结果： 随着β3GalT7 表达的增高，G2+S期细胞增多，且细胞侵袭能力增强；而转染反义表达载体pEGFPC1T7AntiSense的结果是相反的。结论： 过度表达β3GalT7的HL60细胞株体外增殖和侵袭能力增强。
【关键词】 β1，3半乳糖基转移酶7； 正义表达载体； 反义表达载体； 细胞周期； 侵袭
［Abstract］Objective: To explore the effects of β3GalT7 gene on cell cycle, invasive potential of HL60.Methods： Transfect the recombinant plasmids pEGFPC1T7Sense and pEGFPC1T7AntiSense into HL60 with liposomes.Cell cycle and invasive potential of the transfected cells with flow cytometry and transwell plate,respectively. Results： As the upregulation expression of β3GalT7, the cell growth rate increased. At 48 h after transfection, significantly increased invasiveness was noted in HL60 transfected with pEGFPC1T7Sense. Conclusion： Overexpressing β3GalT7 in HL60 enhanced proliferative and invasive potential.
［Key words］beta 1, 3galactosyltransferase 7；plus sense recombinant plasmid； antisense recombinant plasmid；cell cycle；invasive potential
β1,3半乳糖基转移酶家族是糖基转移酶超家族中最具代表性的酶家族之一，β1,3半乳糖基转移酶7(beta1,3galactosyltransferase 7,β3GalT7)基因是我们实验室从人肺cDNA文库中克隆到的人类β3半乳糖基转移酶家族中的一个新成员［1,2］。
在此之前，β1,3半乳糖基转移酶家族已经克隆到6个成员(β3GalT1,T2,T3,T4,T5,T6)［3］。他们都以UDPαD半乳糖（UDPαGal）为供体基团，与之结合，把半乳糖（Gal）转移给受体底物，如各种不同的糖蛋白，糖胺聚糖，糖脂或激素等脂质小分子。研究显示，这些家族的许多成员可能与肿瘤的发生发展和浸润转移有关。在多种肿瘤细胞株中，β3GalT7都有不同程度的表达，而β3GalT7基因在急性粒细胞白血病细胞株HL60细胞中有中度表达。
为进一步阐明β3GalT7与肿瘤增殖和浸润转移的相关性，尤其是在恶性血液病中的作用，我们以HL60细胞株作为研究对象，分别特异性地上调及抑制β3GalT7基因在HL60细胞的表达，从而对其功能进行初步的研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞来源
急性粒细胞白血病细胞株HL60购自上海生化细胞所。
1.1.2 主要试剂
小牛血清购自南京大治生物公司；1640完全培养基：每升RPMI1640基础培养基（Gibco,美国）中，添加小牛血清100 ml、L谷氨酰胺0.15 g，NaHCO3 2.0 g、葡萄糖3.6 g、HEPES(Amresco进口分装)4.7 g；胰蛋白酶购自Sigma公司；DEPC购自上海华舜生物工程公司；六碱基随机引物购自Invitrogen公司；Trizol，RNase Inhibitor，Superscript Ⅱ RNase H Reverse transcriptase购自Invitrogen公司；Taq DNA酶，dNTP MIX（10 mmol/L），10×PCR缓冲液，MgCl2(25 mmol/L)购自Promega公司；DNA 标准参照物购自南京大治公司;琼脂糖购自华美公司（Promega进口分装）。职称论文怎么发表
1.2 方法
1.2.1 细胞转染
通过lipofectamine 2 000脂质体介导的方法将正义重组载体pEGFPC1T7Sense 和反义重组载体pEGFPC1T7AntiSense及空表达载体pEGFPC1分别转染急性粒细胞白血病HL60细胞，分别命名为HL60S,HL60AS及HL600。48 h后收集细胞，在荧光显微镜下观察转染后细胞。
1.2.2 β3GalT7 mRNA表达的RTPCR检测
分别收集处于生长对数期的细胞按 Trizol Reagent(Invitrogen公司) 操作手册提取总 RNA, 1%甲醛变性琼脂糖电泳检测 RNA完整性。取总 RNA 2 μg反转录为 cDNA第1链,再进行 PCR扩增。扩增产物以 2%的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色,图像分析仪摄像并分析结果。设计引物采用Genetyx软件,并经基因库Blast进行同源检索后合成。引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列为：正义链 5′CTATGTGCCCGAGTCCTTCTTCG3′(13241346 nt），反义链5′GCAGTTGTTTCCAGAGCCGAATG3′(16031625 nt)，预期扩增产物长度302 bp。PCR反应体系50 μl,反应条件: 95℃预变性 3 min, 95℃ 30 s, 56℃ 45 s, 72℃ 1 min,35个循环,72℃延长 10 min。
1.2.3 蛋白质印迹检测β3GalT7在蛋白水平的表达
用蛋白质印迹方法(按分子克隆操作)，检测转染细胞中β3GalT7表达的变化。
1.2.4 流式细胞术检测细胞周期的变化
待测样本制成单细胞悬液，然后2 000 g离心5 min，弃上清。用4℃预冷的70%乙醇固定，4℃保存，固定18 h以上。调整细胞浓度为106细胞/ml，取1 ml细胞悬液，用PBS洗3次，细胞重悬于1 ml碘化丙啶(propyldium iodide,PI)染液中，37℃孵育30 min即可进行流式分析G1期和G2，S期比例。PI染液终浓度为50 μg/ml，RNase终浓度为20 μg /ml。
1.2.5 转染细胞的体外穿膜实验
采用Transwell Polycarbonate Membrane模拟体外细胞侵袭模型。上下室之间置8 μm 微孔滤膜,将Matrigel稀释成5 mg/L，膜上铺50 μl稀释的Matrigel;下室加入含有5 mg/L纤维连接蛋白的无血清培养基，上室加预处理的转染48 h和对照组HL60细胞悬液,调节浓度为1×105/室，各取 200 μl。37 ℃,5% CO2饱和湿度下培养24 h,取出insert槽，将下层溶液混匀，对其中的细胞进行计数，得出穿膜细胞占总细胞数的百分比，代表细胞侵袭力。
1.2.6 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件，计量资料数据用均值±标准差(±s)表示，两组间均数比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 荧光成像系统观察转染后细胞
将细胞置于荧光显微镜下，可以看到转染后的HL60细胞在激发波长为507 nm时发出绿色荧光(图1)。
2.2 RTPCR检测β3GalT7 mRNA的表达
转染pEGFPC1T7Sense载体的HL60S组细胞的β3GalT7 mRNA表达量相对于空白对照的HL60细胞株有了明显提高，而HL60AS组细胞株相对于空白对照的HL60细胞株其β3GalT7 mRNA表达量得到了抑制，转染pEGFPC1空载体的HL600组细胞的β3GalT7 mRNA表达量相对于空白对照没有明显变化（图2)。
2.3 蛋白质印迹检测转染细胞β3GalT7蛋白表达量
将4组细胞HL60,HL600,HL60S,HL60AS提取蛋白进行蛋白质印迹检测β3GalT7的表达情况。发现转染了pEGFPC1T7Sense载体的HL60S细胞其β3GalT7的蛋白表达量有所增加，而转染了pEGFPC1T7AntiSense载体的HL60AS细胞其β3GalT7的蛋白表达则受到了抑制，转染了空载体的HL600 细胞β3GalT7蛋白表达无明显变化(图3)。
2.4 流式细胞术检测细胞周期的改变
收集转染后48 h的细胞进行细胞周期分析，结果显示：转染β3GalT7上调表达HL60细胞G2期和S期比例（70.1±3.24）%高于对照组（65.2±2.38）%（P<0.05），转染β3GalT7下调表达的HL60细胞G2期和S期比例（55.8±3.82）%低于对照组（P<0.05），转染空表达载体的G2期和S期比例（66.7±2.52）%和对照组比较差异无统计学意义。
2.5 转染细胞的体外穿膜实验结果
转染后48 h，Transwell板检测发现pEGFPC1T7Sense组下槽细胞占细胞总数的(11.82±1.18)%，pEGFPC1T7AntiSense组下槽细胞占细胞总数的（3.24±0.89）%，pEGFPC1载体组下槽细胞占细胞总数的(8.05±1.45)%。对照组下槽细胞占细胞总数的(6.92 ±1.21)%。pEGFPC1T7Sense组细胞侵袭能力明显高于对照组（P<0.05），而pEGFPC1T7AntiSense组细胞侵袭能力明显低于对照组（P<0.05），pEGFPC1组细胞侵袭能力和对照组比较差异无统计学意义(图4）。职称论文怎么发表
3 讨论
细胞癌变过程中常伴有糖链结构改变, 目前认为肿瘤细胞糖蛋白糖链结构异常是恶性转化和肿瘤转移的普遍特征，如糖链分支末端出现重复N乙酰氨基半乳糖结构、唾液酸和岩藻糖含量增加等,这些变化在临床上常用作肿瘤标记物。糖链结构改变可反映在细胞表面糖复合物上,也可反映在分泌的糖复合物中,而主要是在细胞表面糖复合物上。因此,细胞表面的改变必然对癌细胞之间及癌细胞与细胞外基质之间的相互作用产生影响,对癌细胞的行为如癌瘤增大、侵袭与转移等也产生重要影响。肿瘤细胞表面的糖蛋白糖链结构异常的基础是糖基转移酶的变化，因此有人认为，糖基转移酶就是通过影响糖链的改变,而间接关系到癌瘤的发展。Ishida等［4］曾报道β3GalT7（β3GnT8）在结肠癌中显著上调，与结肠癌关系密切。
过去有研究对来自各类白血病患者的细胞以及白血病细胞株中糖基转移酶活性进行检测，结果显示，除了慢性淋巴性白血病中岩藻糖基转移酶活性较正常低外，其他被测酶的活性都是白血病细胞较正常细胞高，而且各种酶之间表达分布也有明显差异。本室之前的研究表明，β3GalT7基因在HL60细胞中呈中度表达，在本研究中，我们通过将本室构建好的β3GalT7正义与反义表达载体转染人HL60细胞，来上调及抑制β3GalT7基因在HL60细胞的表达，初步研究β3GalT7基因的生物学功能。
在肿瘤细胞表面类似黏蛋白的糖蛋白中有丰富的O糖基化结构域，在肿瘤的转移和浸润生长过程中黏蛋白起着重要的作用，O糖基化可能与肿瘤的发生发展密切相关［5］。在O糖基化过程中，β1,3半乳糖基转移酶家族发挥重要功能。我们的研究发现，细胞转染了pEGFPC1T7Sense后G1期细胞减少，G2期和S期细胞增多，细胞增殖速度加快；而转染了pEGFPC1T7AntiSense载体后G2期和S期细胞减少。大多数聚糖位于细胞和分泌的大分子的外周表面，他们处在调控和介导多种细胞-细胞和细胞-基质相互作用的位置。由于糖基转移酶的表达异常可能会引起糖链结构的改变和糖基化位点出现异常，而蛋白质糖基化的改变与许多细胞生物学效应密切相关。在肿瘤细胞浸润和转移过程中基质金属蛋白酶的表达受多水平严格调控，β3GalT7作为糖基转移酶，其表达的上调或抑制影响了细胞表面的糖蛋白糖链结构，从而影响受体配体结合，细胞通路及信号转导等生物学行为，因而或许带来表达调控基因的改变。另一方面也有可能因为β3GalT7表达的异常增高，带来糖链异常，有利于癌细胞之间或癌细胞与基质之间作用，促使肿瘤浸润转移，导致肿瘤转移相关因子表达增加，而这些因子高表达反过来又促进肿瘤增殖侵袭转移，形成恶性循环。我们推测β3GalT7表达上调可能在肿瘤细胞的侵袭中起到促进作用，这和Transwell体外穿膜的结果是一致的。鉴于以上结果我们推测β3GalT7与肿瘤的增殖和浸润转移是密切相关的，但其具体机制有待进一步探讨。
【参考文献】
［1］Huang C, Zhou J, Wu S，et al.Cloning and tissue distributrion of a the human β3GalT7 gene, a member of the β1,3Glycosyltransferase family［J］.Glycoconj J，2004，21(5): 267-273.
［2］周嘉梁, 黄超群, 吴士良，等.人类新型β3半乳糖基转移酶基因β3GalT7的克隆和鉴定［J］.生物化学与生物物理进展，2005,32(2): 140-146.
［3］Bai X, Zhou D, Brown JR, et al. Biosynthesis of the linkage region of glycosaminoglycans: cloning and activity of galactosyltransferase Ⅱ, the sixth member of the beta 1,3galactosyltransferase family(beta 3GalT6)［J］. J Biol Chem，2001，276(51): 48189-48195.
［4］Ishida H, Togayachi A, Sakai T, et al. A novel beta1,3Nacetylglucosaminyltransferase(beta3GnT8), which synthesizes polyNacetyllactosamine, is dramatically upregulated in colon cancer［J］. FEBS Lett, 2005, 579(1): 71-78.
［5］Hassan H, Reis CA,Bennett EP, et al. The lectin domain of UDPNacetylDgalactosamine: polypeptide Nacetyl galactosaminyltransferaseT4 directs its glycopep tide specificities［J］. J Biol Chem, 2000,275(49) : 38197-38205.
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