巨噬细胞炎症蛋白2在急性胰腺炎大鼠肺损伤中的作用
【摘要】 目的： 研究巨噬细胞炎症蛋白2(MIP2)与急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP)大鼠肺损伤的关系。方法： 雄性SD大鼠，随机分为5组，即正常对照组，AP 3 h,AP 6 h,AP 12 h,AP 24 h组，胰胆管逆行注射脱氧胆酸钠，制备大鼠急性胰腺炎模型。测定血清淀粉酶，测定肺组织MIP2含量和髓过氧化物酶（MPO）活性，胰腺组织和肺组织病理学检查及评分。结果： AP 3 h组肺组织中MIP2的含量即明显升高，6 h达到高峰，和正常对照组比较差异有统计学意义；肺组织中MPO活力3 h开始升高，并随时间推移而逐渐升高；AP 3 h组肺组织及胰腺组织病理学评分明显高于正常对照组，在6 h及以后时段损伤表现更为严重。本研究结果中肺镜下病理评分与胰腺镜下病理评分(r=0.35,P<0.05）、肺组织MPO活性（r=0.42,P<0.05）呈正相关。结论： 急性胰腺炎病理过程中，MIP2作为早期的促炎性细胞因子，趋化和激活了以中性粒细胞为主的炎性细胞，介导了肺损伤。
【关键词】 苏州大学附属第二医院 1.普外科; 2.检验科, 江苏 苏州 215004
［Abstract］Objective: To investigate the changes of macrophage inflammatory protein 2(MIP2)in lung injury induced by acute pancreatitis(AP).Methods： SD rats were divided at random into five groups：AP 3 h group，AP 6 h group，AP 12 h group,AP 24 h group and control group， Rat AP model was induced by intraductal administration of 5% sodium deoxycholate（DCA）.Animals were sacrificed at 3,6,12,24 hours after induction of pancreatitis.The following parameters were measured:Serum amylase, the intrapulmonary content of MIP2,myeloperoxidase(MPO) activity, histopathological scoring of lung and pancreatic tissues. Results： The intrapulmonary content of MIP2 increased significantly in AP 3 h group, with peaking around 6 hours. Myeloperoxidase(MPO) activity overpressed in AP 3 h group and persisted up to 12～24 hours. Histopathological Score of lung tissues correlated well with Histopathological Score of pancreatic tissues(r=0.35,P<0.05）and intrapulmonary MPO(r=0.42,P<0.05）. Conclusion： MIP2 was highly correlated with lung injury induced by AP, may induce pulmonary leucocyte infiltration and activation in the early stage.
［Key words］macrophage inflammatory protein2; acute pancreatitis; lung injury
巨噬细胞炎症蛋白2(macrophage inflammatory protein 2，MIP2)是大鼠ELR+(含谷-亮-精氨酸功能基序)CXC类趋化性细胞因子,在功能上和人类IL8同源，是中性粒细胞的主要趋化细胞因子［1］。急性肺损伤是急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）最常见和最突出的胰外脏器损伤之一，也是急性胰腺炎患者早期死亡的主要原因之一，有报道重症急性胰腺炎发病1周内死亡的患者中，60％源于肺损伤［2］。本研究通过大鼠急性胰腺炎模型，探讨MIP2在大鼠急性胰腺炎肺损伤中的作用。
1 材料与方法工程论文发表
1.1 主要材料
脱氧胆酸钠为AMSCO公司产品；rMIP2/GROβELISA试剂盒为Biosource公司产品；髓过氧化物酶（MPO）试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；DADE全自动生化分析仪，美国德林公司；Triturus ELISA全自动检测仪，Dako公司；Biofuge 22R高速低温离心机，Heraeus公司；DY891电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Libror AEU210精密电子秤(敏感度0.1 mg)，日本。
1.2 实验动物及分组
健康清洁级雄性SD大鼠30只，体质量250～300 g，苏州大学实验动物中心提供。完全随机化设计，分为5组即正常对照组，AP 3 h,AP 6 h,AP 12 h,AP 24 h，每组6只。
1.3 实验方法
1.3.1 模型制备及取材
参照许利剑等［3］的方法制备大鼠急性胰腺炎模型：胰胆管逆行注射50 g/L脱氧胆酸钠，剂量为1 ml/kg，匀速注射1 min，保留5 min,正常对照组除不注射脱氧胆酸钠外，余操作同AP组。取下腔静脉血离心后用全自动生化分析仪测定血清淀粉酶；切取肺组织2份，各约100 mg,用于MIP2含量和MPO活性测定；分别取胰头组织和肺组织做病理学检查。
1.3.2 肺组织MIP2含量测定
肺组织用10倍体积的预冷匀浆介质(含20 mmol/L pH7.4 PBS, 1 mmol/L PMSF和β琉基乙醇及EDTA, 5 g/L Triton X100)制成匀浆，4℃, 14 000 r/min离心5 min，取上清液分成2份，一份用ELISA法检测MIP2浓度，采用ELISA全自动检测仪按rMIP2/GROβELISA试剂盒供应商提供的说明书设定反应步骤；一份用全自动生化分析仪测定蛋白含量。肺组织的MIP2含量用pg/mg蛋白表示:
MIP2含量(pg/mg)=组织匀浆中的MIP2浓度（pg/ml）组织匀浆中的蛋白含量（mg/ml）
1.3.3 肺组织MPO活性测定
取肺组织约100 mg，加入0.5%HTAB 2 ml,反复冻融并经超声粉碎，离心，取上清液0.1 ml，加入反应液2.9 ml，在分光光度计460 nm波长下扫描，记录第30 s和90 s光密度的差值，以此反映酶活力的改变［4］。
MPO活力单位(U/g)=△D(460 nm)/min11.3×所加组织量（g）/反应液（L）
1.3.4 病理学检查
胰腺和肺组织标本常规固定、包埋、HE染色，病理科医师在光镜下观察胰腺及肺组织学改变。胰腺组织镜下病理评分采用Schmidt评分法［5］，以总分计；参照Pastor等［6］的方法进行肺组织学观察与评分。
1.4 统计学处理
采用SPSS10.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义，相关性检验采用线性回归分析。
2 结 果
大鼠血清淀粉酶、肺组织MPO活性及MIP2含量、肺和胰腺组织病理评分结果见表1。正常对照组大鼠肺组织在光镜下未见明显病理变化；急性胰腺炎后3 h已出现肺组织损害，表现为肺泡间隔增宽、间质和肺泡出血、炎性细胞浸润，随着时间推移，损害更加明显。肺镜下病理评分与胰腺镜下病理评分(r=0.35,P<0.05）、肺组织MPO活性（r=0.42,P<0.05）呈正相关。表1 各组大鼠血清淀粉酶、肺组织MPO活性、肺组织MIP2含量、肺和胰腺病理评分的动态观察（略）
3 讨论
肺损伤是重症急性胰腺炎最常见和最突出的胰外脏器损伤之一，目前大量研究已经证实：中性粒细胞在肺部的浸润和活化是急性胰腺炎肺损伤发生的关键所在，但其在肺部的浸润、活化的机制尚未阐明。近年来MIP2在其中的作用引起了关注。
MIP2是1988年Wolpe等首次发现的一种新的蛋白质，可分为MIP1,MIP2,MIP3,MIP4,MIP5共5种亚型。其中，MIP2是一种与急性肺损伤密切相关的趋化性细胞因子，是CXC亚家族成员之一，其氨基末端前2个半胱氨酸被1个其他氨基酸相隔，基因定位于人4号染色体，鼠5号染色体［7］。MIP2由“α”和“β”两种蛋白质亚单位组成，相对分子质量为6 kD。MIP2是人IL8的一个功能类似物［1］,通过对炎性细胞的化学趋化和活化作用而参与炎症的全过程，其特异性靶细胞为中性粒细胞，大鼠中性粒细胞表面有对MIP2高度亲和的受体CXCR2，是MIP2对中性粒细胞具有选择性趋化和活化活性的结构基础。 CXCR2活化后可引起白细胞内游离钙升高，引起细胞骨架系统功能变化，导致白细胞变形、附壁、伪足形成并游出；具有肝素的结合位点，可与内皮细胞外基质中肝素硫酸葡聚糖相互作用，从而使得白细胞和血管内皮细胞的黏附更为牢固［8］。另一方面MIP2还可动员骨髓中的白细胞释放入血,当MIP2浓度在1～10 mmol/L时，还可引起白细胞“呼吸爆发”［9］。Pastor等［6］就发现在雨蛙素诱导的小鼠AP肺损伤模型中, 用抗MIP2抗体分别在制膜前后进行干预，可显著抑制中性粒细胞浸润、减轻胰腺和肺组织损伤的严重程度。工程论文发表
MPO存在于中性粒细胞的嗜天青颗粒中，约占细胞干重5％,通过检测MPO的活力可以推算出中性粒细胞的数量［4］。
本研究结果表明大鼠胰胆管逆行注射脱氧胆酸钠后3 h，肺组织中MIP2的含量即明显升高，6 h达到高峰，12 h时开始下降；肺组织中MPO活力3 h开始升高，并随时间推移而逐渐升高；从肺组织病理学检查可见大鼠急性胰腺炎模型在3 h即可出现肺损伤：肺组织充血、肿胀，肺间质增宽，间质及肺泡出血、水肿、炎性细胞浸润，在6 h及以后时段表现更为严重。本研究结果中肺镜下病理评分与胰腺镜下病理评分、肺组织MPO活性呈正相关，说明急性胰腺炎原发病变和急性胰腺炎肺损伤密切相关，中性粒细胞在肺部的浸润和活化介导了肺损伤。MIP2可能是炎症早期的促炎性细胞因子，其在炎症早期的短期急剧释放可能趋化和激活了中性粒细胞等炎症细胞，使之在肺内大量浸润聚集，从而启动与维持炎症反应导致肺损伤。关于MIP2的产生机制，目前研究不多，主要由激活的单核巨噬细胞、血管内皮细胞和中性粒细胞在LPS,TNFα,IL1等刺激下产生。我们的研究表明急性胰腺炎病理过程中，MIP2作为早期的促炎性细胞因子，趋化和激活了以中性粒细胞为主的炎性细胞，介导了肺损伤。
【参考文献】
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