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幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

作者:时间:2011-03-24 14:47:00 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:1002次 ]

【摘要】目的：构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)Cag致病岛(Cagpathogenicity island，CagPAI)编码的hp0540基因的原核表达系统，并制备其多克隆抗体。方法：应用PCR技术从Hp11637基因组DNA中扩增hp0540基因片段，克隆至pMD182T载体后，进行序列测定，并对其序列进行生物信息学分析;构建pET28ahp0540原核表达载体，转化表达宿主菌BL21DE3;经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE法鉴定目的蛋白的表达，并以Ni2+NTA柱分离纯化目的蛋白;将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并测定抗体效价。结果：成功克隆了hp0540基因，全长1 086 bp，编码361个氨基酸，与基因库公布的其他Hp菌株基因序列的核苷酸同源性为98%。工程菌诱导后SDSPAGE显示新生表达蛋白带，相对分子质量约为39 000，经Ni2+NTA柱纯化后可获得重组蛋白，重组蛋白免疫新西兰大白兔后获得效价为1∶160 000的多克隆抗体。结论：成功构建了hp0540基因的原核表达系统并制备了其多克隆抗体，为研究该基因的功能奠定了基础。

【关键词】幽门螺杆菌; Cag致病岛; CagI; 多克隆抗体教育类论文发表

　　[Abstract] Objective: To construct the expression system of hp0540 from strain NCTC11637 of Helicobacter pylori(Hp) and prepare the polyclonal antibody serum of CagI. Methods: The hp0540 gene was amplified by PCR with the genomic DNA of Hp NCTC 11637 as template. The plasmid pMD182Thp0540 was constructed via TA clone method and sequenced. The sequence of hp0540 was analyzed through bioinformatics approach. The expression vector pET28ahp0540 was constructed and transformed into E.coli BL21DE3 by molecular cloning method. The protein was expressed and characterized via SDSPAGE method after induced by IPTG. The target protein CagI was purified and collected by Ni2+NTA agarose. The puried protein was used to immunize rabbit to prepare polyclonal antibody serum. Results: The hp0540 has been cloned successfully. The sequence analysis for hp0540 showed that it shared 98% homology with other strains of Hp in GenBank. The molecular mass of the purified protein was 39 000. The potency of the polyclonal antibody serum was 1∶160 000. Conclusion: We constructed the prokaryotic expression system and prepared the polyclonal antibody serum successfully, which established a foundation for the function investigation of the hp0540.

　　[Key words] Helicobacter pylori; Cagpathogenicity island; CagI; polyclonal antibody

　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一微需氧革兰阴性细菌，世界上有50%人口因感染该菌而导致慢性胃炎、消化性胃溃疡、胃腺癌、淋巴样组织瘤等消化道疾病，世界卫生组织于1994年将其列为第一类致癌原[1-3]。高致病性菌株都含有一长度为40 kb的Cag致病岛(Cagpathogenicity island，CagPAI)，用以编码四型分泌系统(type IV secretion system，TFSS)，通过该系统细菌可以把一些诸如细胞毒素抗原(CagA)、空泡毒素A(VacA)、肽聚糖等致病因子注入宿主细胞，并进而引起细胞在增殖、骨架重排、细胞连接、形态延伸与散射等方面的改变[4]。hp0540是CagPAI内的第19号基因，与根癌农杆菌的TiDNA转运系统中的基因不具有同源性，由hp0540编码的CagI蛋白是TFSS的一伴侣样蛋白。有研究表明CagI蛋白可以与新近发现的宿主整合素受体β1发生相互作用，从而影响毒力因子CagA的转运，但其具体的作用机制及完整的功能尚不清楚[5]。因此，本文通过对CagPAI中的hp0540基因进行克隆表达及其多克隆抗体的制备，将为进一步研究该基因在Hp致病机制中的作用奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株 Hp NCTC11637购自中国预防科学院流行病学研究所,大肠埃希菌DH5α及BL21DE3为江苏大学医学技术学院中心实验室保存。

　　1.1.2 主要试剂和仪器哥伦比亚培养基、厌氧袋购自OXOID公司;ExTaqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ，T4DNA连接酶(快速连接试剂盒)、IPTG、2 000 bp、15 000 bp DNA 标准参照物及蛋白质分子量标准(低)均购自TaKaRa公司;10 kb DNA 标准参照物购自TOYOBO;Ni2+NTA购自Qiagen公司;pET28a载体由江苏大学医学技术学院中心实验室保存;PCR基因扩增仪(Mastercycler Gracent，Eppendor公司)、自动凝胶成像系统(美国UVP公司)，其他常规试剂按照《分子克隆实验指南》配制。

　　1.2 方法

　　1.2.1 Hp的培养与鉴定及基因组DNA提取 Hp NCTC11637标准菌株按常规微需氧方法进行培养与鉴定。DNA用常规酚、氯仿抽提法获得，-20℃保存备用。

　　1.2.2 hp0540基因的克隆及工程菌的构建根据基因库中已报道的Hp26695 NC_000915的hp0540基因序列进行信号肽预测，显示前60 bp编码信号肽，去除前60 bp后利用软件Primier5.0设计引物： p1:5′ATAGAATTCACAGAAGTAGTAATAACGCTTGAAC3′(34 bp);p2:5′AGACTCGAGTTTGACAATAACTTTAGAGCTAG3′(34 bp)。在上游引物5′端加EcoR Ⅰ酶切位点;在下游引物5′端加Xho Ⅰ酶切位点。预期的PCR 产物长度为1 086 bp。引物由上海生工生物技术有限公司合成。以HpNCTC11637菌株基因组DNA为模板,按照常规PCR条件进行扩增, 反应体积为50 μl。反应条件: 94℃预变性10 min, 94℃ 50 s, 60℃ 45 s, 72℃ 50 s, 30个循环,最后于72℃延伸10 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析后，用DNA回收试剂盒进行回收纯化。将纯化的PCR 产物克隆到载体pMD182T上, 连接产物转化大肠埃希菌DH5a，选择阳性克隆进行酶切鉴定。用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鉴定阳性质粒pMD182Thp0540,双酶切得到目的基因片段,然后连接到原核表达载体pET28a，连接产物转化大肠埃希菌BL21DE3,酶切鉴定阳性重组质粒pET28ahp0540获得重组工程菌。

　　1.2.3 DNA序列测定分析及编码蛋白特性预测将经过鉴定的阳性重组质粒寄至上海生工测序。基因片段的同源性分析使用NCBI 的Blast在nr数据库中对基因的同源性进行比对分析; 应用软件DNAStar分析hp0540编码氨基酸序列的理化特性。登陆SMART数据库预测与CagI(hp0540)具有相互作用的蛋白并进行同源性比对。

　　1.2.4 目的蛋白的表达纯化与抗体的制备取经酶切鉴定构建成功的重组工程菌,接种于含卡那霉素的3 ml LB液体培养基中,在37℃振荡培养至光密度D(600 nm)为0.6时，以不同浓度的IPTG诱导不同的时间后收集菌液,用PBS洗涤3 次, SDSPAGE检测,以未经转化的大肠埃希菌BL21DE3及转化空载体pET28a诱导的菌液为阴性对照。确定表达的最佳条件后，大量诱导工程菌，按镍柱Ni2+NTA 纯化目的蛋白步骤提取重组蛋白。以纯化蛋白为抗原加弗氏佐剂免疫新西兰大白兔制备兔抗重组蛋白多克隆抗体血清，以ELISA鉴定其免疫性。

　　2 结果教育类论文发表

　　2.1 Hp的分离培养与鉴定

　　培养96 h后的NCTC11637经革兰染色，在油镜下可见海鸥状、弧形、s形的革兰阴性菌，尿素酶、氧化酶、触酶试验均阳性。

　　2.2 hp0540基因PCR扩增结果

　　PCR结果显示在1 086 bp附近出现了条带(图1)，与预期大小相符，无非特异性条带。

　　2.3 TA克隆重组质粒的筛选与鉴定

　　将胶回收后的PCR产物与pMD182T载体连接，产物转化至感受态大肠埃希菌DH5α，涂板、37℃培养12 h后随机挑取单菌落摇菌，提取质粒，双酶切鉴定产物，电泳结果显示在3 000 bp与1 086 bp左右出现条带(图2)。

　　M：10 kb DNA标准参照物; 1：EcoR Ⅰ单酶切鉴定pMD182Thp0540; 2：EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定pMD182Thp0540;3：PCR产物

　　2.4 重组表达质粒的酶切鉴定

　　将酶切鉴定为阳性的TA质粒与pET28a载体分别用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，回收目的片段，16℃连接过夜后转化至感受态大肠埃希菌Bl21DE3，涂板、37℃培养12 h，随机挑取单菌落摇菌，提取质粒，双酶切鉴定产物电泳结果显示大约在5 000 bp与1 086 bp处出现条带(图3)。

　　M1：2 000 bp DNA标准参照物; 1：PCR 产物; 2：EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定pET28ahp0540; 3：EcoR Ⅰ单酶切鉴定pET28ahp0540; M2：15 000 bp DNA标准参照物

　　2.5 hp0540基因片段的序列测定及编码蛋白的理化特性预测

　　将鉴定后的重组质粒送往上海生工进行核苷酸序列测定，DNA测序结果表明，构建的重组质粒上的hp0540长度为1 086 bp，与设计序列大小完全一致。将测得序列分别与已知的两种国际标准菌株Hp26695和J99的hp0540基因的核苷酸序列进行比对，同源性分别为98%(1067/1086)、 98%(1066/1078)。应用DNAStar软件分析得到CagI(hp0540)的相对分子质量为39 377，等电点PI为5.35。应用JamesonWolf法对其抗原性进行了分析(图4)。登录SMART数据库进行的相关蛋白预测显示：CagI蛋白可能与致病岛中的CagL(0.869)、CagH(0.831)、CagA(0.800)、CagG(0.774)、CagF(0.613)、CagE(0.613)、CagD(0.594)、CagC(0.594)等蛋白(括号内为可信度)具有相互作用。

　　2.6 目的蛋白在大肠埃希菌中的表达

　　将重组质粒pET28ahp0540 转化大肠杆菌BL21DE3,经IPTG诱导表达,收集菌液进行SDSPAGE电泳检测。结果显示在大约40 000 处有特异性条带(图5) ，与预期大小一致,而作为对照的宿主菌与pET28a空质粒宿主菌在相应位置未见到蛋白条带。

　　M：蛋白标准参照物;1：E.coli BL21DE3 菌株;2：转化了pET28a空载体的E.coli BL21DE3;3：转化了重组质粒却未经IPTG诱导的E.coli BL21DE3;4、5：转化了重组质粒并经IPTG诱导的E.coli BL21DE3

　　2.7 多克隆抗体的制备与效价测定

　　将纯化蛋白免疫家兔，获得抗CagI多克隆抗体，以免疫之前兔的血清作为阴性对照，对抗体进行倍比稀释后做ELISA，测得抗体效价为1∶160000。

3 讨论

　　在幽门螺杆菌的致病机制中，由Cag致病岛编码的蛋白所组成的TFSS构成了其最重要的致病因子之一[6-9]。除幽门螺杆菌外，TFSS还存在军团杆菌属、巴尔通(氏)体属、博德特氏菌属等病原菌中，在这些病原菌中TFSS拥有的一个共同功能就是可以将一些致病因子转移至宿主细胞，进而引发相应的疾病[10-12]。在幽门螺杆菌致病机制的前期研究中，已经表明四型分泌系统的伴侣样蛋白CagL可与宿主细胞表面的整合素a5β1受体发生相互作用，从而启动细菌主要毒力因子CagA的转运，并激活细胞内的信号级联放大反应，进而引起一系列的病理变化[6]。最新的研究揭示了CagA的转运还依赖于宿主细胞的另一整合素受体β1， JiménezSoto等[5]已通过酵母双杂交的方法证实了CagA的N端，CagY(hp0527)的C端及CagI(hp0540)均与整合素β1具有相互作用。教育类论文发表

　　随着伴侣样蛋白CagL可启动细菌主要毒力因子CagA转运的发现，伴侣样蛋白在致病机制中的作用已逐渐引起了重视。幽门螺杆菌CagA蛋白转运的伴侣样蛋白除CagL与CagI外，还包括CagZ(hp0526)、CagU(hp0531)、CagM(hp0537)、CagN(hp0538)、CagG(hp0542)、CagF(hp0543)、CagD(hp0545)。Fischer等[13]的研究表明，在这些蛋白中，CagZ与CagI对于CagA转运是必需的，但对IL8的诱导并不产生影响，而CagN、CagG、CagF、CagD对CagA的转运与IL8的诱导都是必需的，可能与这几种蛋白具有稳定TFSS结构的功能有关。另有研究表明CagM对于hp0532基因的表达具有调节作用，而对CagU蛋白的功能研究却未见报道。目前，对于这些基因的研究尚不够深入与全面，而全面地揭示这些基因的功能，对于更好地认识幽门螺杆菌的致病机制及其四型分泌系统的结构都极为必要。

　　本研究成功地克隆了幽门螺杆菌NCTC11637的hp0540基因，并制备了CagI蛋白的多克隆抗体。DNA测序后的序列比对结果表明，该基因具有高度保守性，与Hp其他菌株的同源性达到了98%。在SMART数据库进行的相关蛋白预测显示，CagI可能与致病岛中的CagL、CagH、CagA、CagG、CagF、CagE、CagD、CagC等蛋白具有相互作用。这将为进一步研究该基因对CagA的转运、TFSS的组装及其致病相关因子的相互作用奠定了基础，从而更好地揭示该基因在幽门螺杆菌致病机制中的作用。

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