槐定碱预防小鼠内毒素性肝损伤的作用及对肝脏CD14、TLR4表达的影响
【摘要】 目的 研究预防性给予槐定碱对小鼠内毒素血症急性肝损伤的影响及对CD14、TLR4表达的调节。方法 观察槐定碱12、6、4mg/kg三个剂量预防性处理的小鼠，在给予内毒素后2、6、12、24h时各组小鼠一般状况、肉眼及光镜下肝组织的病理变化，赖氏法测定血清丙氨酸氨基转氨酶(ALT)浓度，RT-PCR与Western Blot分别检测肝组织CD14及 TLR4 的 mRNA 与蛋白表达，放免法检测血清TNF-α含量的变化。结果 槐定碱三个剂量预防性给予，各个时间点结果均表明改善了内毒素血症模型小鼠的一般状况，减轻了肝组织病理改变；槐定碱三个剂量组的ALT值均低于同时间点的LPS模型组（P＜0.01或P＜0.05）；槐定碱三个剂量组与同时间点LPS模型组比较，均下调肝组织CD14 、TLR4 mRNA和蛋白的表达（P＜0.01或P＜0.05）；槐定碱三个剂量组血清TNF-α水平均较同时间点LPS模型组降低（P＜0.01或P＜0.05），并在24h时均降至正常对照组水平。结论 槐定碱12、6、4mg/kg三个剂量预防性给予，可抑制内毒素血症小鼠肝脏炎症反应，其机制可能与下调LPS识别受体CD14、TLR4表达，并进而抑制下游炎症因子分泌有关。
【关键词】 苦豆子；槐定碱；内毒素；肝脏；CD14；Toll样受体4图书馆论文发表
Abstract: Objective To observe the preventive effect of Sophoridine on liver inflammatory reaction of mice with endotoxemia，and its effect on the expression of CD14 and TLR4.Methods The ICR mice were administered by three dosage of Sophoridine, that was high doses (12mg/kg), middle doses（6mg/kg）and low doses（4mg/kg）. 2，6，12，24 hours after LPS injection, general symptoms were recorded,the blood and liver samples were taken and pathological damages of liver were checked. The level of alanine aminotransaminase(ALT) in serum was measured by Reitman mensurate rating. Reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) was employed to detect the mRNA expression of CD14 and TLR4 in liver. Protein expression of CD14 and TLR4 in liver were assessed by Western Blot. Serum TNFα levels were determined by radio immunoassay. Results The results of three dosage of Sophoridine pretreated groups at each timepoint showed that Sophoridine could ameliorate the general symptoms of endotoxic liver injury models significantly and decrease pathological damage of liver tissue. The three Sophoridine group with different doses showd a significantly lower ALT value than that in the LPS model at the same time point（P＜0.01 or P＜0.05）； compare to the LPS model, the express of CD14 , TLR4 mRNA and proteins in the liver of the three different doses sophoridine group were downregulated significantly（P＜0.01 or P＜0.05）, and the levels of serum TNFα of three Sophoridine group were significantly reduced than those in the LPS model at the same time point（P＜0.01 or P＜0.05）, and they reached the level of normal control groups at 24h.Conclusion The mechanism of Sophoridine antiendotoxin liver injury had a strong relation with downregulating of the expression of CD14 and TLR4, and influence of TLR4 transduction pathway, and restraining secretion of downstream inflammatory factors.
Key words: sophora alopecuroides L; sophoridine; endotoxin; liver; CD14；toll like receptor
细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），即内毒素（endotoxin，ET），是革兰阴性菌（G-菌）的主要病原相关分子模式。G-菌感染引起脓毒症，并进一步导致多器官功能障碍综合征，内毒素是主要病原因素之一。因为抗内毒素药物缺如，内毒素所致疾病一直是临床治疗的棘手难题［1-3］。近年来，Toll样受体4（TLR4）信号转导通路的发现为人们攻克内毒素所致疾病提供了新的方向，将该转导通路中的信号受体作为靶位, 以阻断炎症的级联反应,从而防止失控性炎症发生，已成为开发新的抗内毒素药物的途径之一。苦豆子(Sophora alopecuroides L)为豆科槐属植物，槐定碱是苦豆子中含量较高的生物碱之一。本课题组以往研究发现，槐定碱对内毒素肺损伤小鼠模型具有显著的保护效应［4］，有必要对其进行更为深入的研究。肝脏是机体清除内毒素的主要器官，同时也是内毒素血症时受损最早、最明显的靶器官之一［5］。本研究通过建立小鼠内毒素血症急性肝损伤模型，观察预防性给予槐定碱对小鼠内毒素性肝损伤的作用，探讨其作用是否与调节LPS 识别受体CD14、TLR4表达有关。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂和仪器
LPS(E.coli 055∶B5), Sigma公司产品;槐定碱(批号:960324 ，mp 109℃，含量98%以上)购于宁夏药物研究所; 丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒购于北京北化康泰临床试剂有限公司；RT-PCR试剂盒购于美国Promega公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于江苏碧云天生物技术有限公司；兔抗小鼠TLR4、 CD14多克隆抗体购于美国Santa Cruz 公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG购于北京中杉金桥生物有限公司；小鼠TNF-α放免分析试剂盒购于北京科美东雅生物技术有限公司。
1.1.2 动物
ICR小鼠,清洁级,均为雄性,6～8周龄,18～22 g,宁夏医科大学实验动物中心提供,动物许可证号：SCXK(宁)2005-0001。
1.2 方法
1.2.1 药物
参照小鼠腹腔注射槐定碱的LD50（58.0 mg/kg）［6］，实验选用槐定碱约1/5、1/10、1/15 LD50三个剂量。
1.2.2 动物模型制备与分组
ICR小鼠腹腔注射LPS(E.coli 055：B5)10 mg/kg(经预试验选定)制备小鼠内毒素血症急性肝损伤模型。
实验小鼠随机分为5组，每组20只，即①正常对照组；②内毒素肝损伤模型组；③④⑤组分别为槐定碱高剂量（12mg/kg ）、中剂量 （6mg/kg ）、低剂量 （4mg/kg ）组。①②组小鼠腹腔注射0.2mL/10g生理盐水，③④⑤组小鼠每天分别腹腔注射槐定碱高、中、低剂量，连续3d；然后，除①组末次注射后30min腹腔注射生理盐水0.2mL外，②③④⑤组均在末次注射后30min腹腔注射LPS 10mg/kg； 随后各组分别在注射LPS后2 、6 、12 、24h四个时间点随机抽取5只小鼠，进行观察检测。
1.2.3 观察指标 图书馆论文发表
各组小鼠分别在给予 LPS后相应时间点记录一般状况并取材，①赖氏法测定血清丙氨酸氨基转氨酶(ALT)浓度：摘小鼠眼球取血置小试管中，血液凝固后，3000r/min离心10min，吸取血清，按ALT检测试剂盒说明书进行操作；②肝脏的病理变化：肉眼观察肝脏形态、色泽、包膜等的改变；取各肝右叶同一部位，置10%中性福尔马林磷酸盐缓冲液固定后,石蜡包埋,HE染色,光镜观察肝组织的病理变化；③ RT-PCR检测肝组织CD14和TLR4 mRNA表达水平：PCR引物由北京赛百盛公司合成。
TLR4引物：5'GCAATGTCTCTGGCAGGTGTA 3'，
5'CAAGGGATAAGAACGCTGAGA 3',片段长度为406bp;
CDl4引物：5'TTGCGGAGGTTCAAG ATG 3'，
5'TGTGGACACGGAAGCAGA 3',片段长度为237bp;
β-actin引物：5'TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC3'，5'TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG3',片段长度为350bp。
提取小鼠肝组织总 RNΑ，采用Promega公司的一步法 RT-PCR 试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作；PCR产物电泳凝胶置于凝胶图像分析系统成像，以 Bio-Image Analysis System 进行半定量分析，结果以相对光密度值 (relative optical density, ROD)×面积(mm2)表示；④Western-Blot检测肝组织CD14和TLR4蛋白表达水平：提取标本的总蛋白；测定样品蛋白浓度（BCA法）；行SDS-PAGE后，用凝胶图像分析成像系统进行扫描分析，以目的条带面积灰度值/内参（β-actin）条带面积灰度值做为半定量检测结果；⑤放射免疫分析法检测血清肿瘤坏死因子（TNF-α）含量：取血清，按试剂盒说明书操作，γ放免计数仪检测，打印出数值。
1.3 统计学方法
实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析进行组间差异表示。应用SPSS11.5软件进行统计学处理，多样本均数间比较采用One-Way ANOVA检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠一般状况的改变
正常对照组小鼠在各时间点均活动自如，进食正常，无病态；槐定碱各剂量组小鼠于末次给药后30min，注射LPS， 2h 时各剂量组小鼠均见活动减少；6h时蜷缩无力，进食减少，低剂量组有口唇发紫，个别有腹泻症状，但高、中剂量组未见口唇发紫及腹泻；12h时各剂量组前述症状缓解；24h时各剂量组小鼠进食、活动基本恢复正常。各时间点的一般状况均明显好于同时间点LPS模型组。各实验组小鼠均无死亡。
2.2 小鼠肝脏的病理学观察
2.2.1 大体观察
正常对照组小鼠肝脏形态正常，色泽红润，包膜光滑，质地柔软。槐定碱各剂量处理小鼠给予LPS后2h 及6h肝脏无明显肉眼可见变化；12h时各剂量组小鼠肝脏均有轻微肿胀；24h时肝脏肿胀较明显，其中低剂量组的部分小鼠肝脏表面可见点状及片状出血点。但与LPS模型组12h及24h时间点相比，槐定碱各剂量组小鼠肝脏充血水肿程度较轻，中、高剂量组未见肝表面有出血点。
光镜观察：正常对照组各时间点肝细胞形态结构正常，肝索排列整齐，未见炎性细胞。LPS模型组2h时无明显变化；6h时肝小叶内血管扩张充血，肝细胞轻微肿胀、有散在炎性细胞浸润；12h时除上述病变更为明显外，部分区域有散在点状及小灶状坏死，部分肝细胞出现双核现象；24h时可见小叶内肝窦扩张充血，肝细胞气球样变，坏死部位见较多淋巴细胞及中性粒细胞浸润，汇管区可见血管扩张充血及炎细胞浸润。槐定碱各剂量组较同时间点LPS组病变明显减轻，24h时病变减轻尤为明显。槐定碱高、中剂量组病变轻于低剂量组。参见图1(见封3)。
2.3 小鼠血清中ALT含量测定
槐定碱三个剂量组的ALT值在2、6h时间点变化曲线与LPS模型组相仿，但均低于同时间点的LPS模型组（P＜0.01或P＜0.05），12h时，LPS模型组的ALT值升至顶峰，而槐定碱三个剂量组则趋于下降，至24h时除低剂量组外均已达到正常水平。图书馆论文发表
槐定碱高、中剂量组在2、6、24h时间点的降ALT效应明显强于低剂量组（均P＜0.05），说明槐定碱降低小鼠血清ALT作用具有一定的量-效关系，高、中剂量组优于低剂量组,见图2。
2.4 小鼠肝组织中CD14 与 TLR4 的mRNA表达
2.4.1 肝组织中CD14 mRNA表达
槐定碱高剂量组在给予 LPS后各时间点肝组织 CD14mRNA表达水平均低于LPS模型组（P均＜0.01），而与正常对照组差异无统计学意义；中剂量组各时间点CD14mRNA表达水平亦均显著低于LPS模型组（P均＜0.01），仅6h时间点CD14mRNA表达明显高于正常对照组；而低剂量组在2、12、24h时间点CD14mRNA表达水平虽均低于LPS模型组（P＜0.05或 P＜0.01），但从2h 起，至12h时均仍明显高于正常对照组（P＜0.05或 P＜0.01），24h时才接近正常对照组水平，见图3、4。
2.4.2 肝组织中TLR4 mRNA表达
模型组小鼠给予 LPS后2h肝组织 TLR4 mRNA表达开始上调，并迅速于 6h 达高峰，以后开始下降（P＜0.01），至 24h 时接近正常对照组水平。槐定碱三个剂量组在给予LPS后TLR4 mRNA表达趋势与LPS模型组相似, 但与同时间点LPS模型组比较，槐定碱三个剂量均表现出下调TLR4 mRNA作用，至12h 除低剂量组外，高、中剂量组已接近正常对照组水平，见图5、6。
2.5 小鼠肝组织中CD14、 TLR4的蛋白表达
2.5.1 肝组织中CD14蛋白表达
模型组在给予 LPS后各时间点CD14蛋白表达趋势与其mRNA表达基本一致。2h肝组织中 CD14蛋白表达开始明显上调，并迅速于 6h 达高峰，以后开始下降，至 24h 仍明显高于正常对照组（P＜0.05），差异有统计学意义。槐定碱高、中、低剂量组在给予LPS后CD14蛋白表达趋势与LPS模型组相似，但除6h低剂量组外各时间点的CD14蛋白表达均显著低于同时间点LPS模型组（P＜0.01或P＜0.05），见图7、8。
2.5.2 肝组织中 TLR4 蛋白表达
LPS模型组小鼠各时间点TLR4蛋白表达趋势与其mRNA表达基本一致。2h肝组织 TLR4蛋白表达开始上调，于 6h 达高峰（P＜0.01），以后开始下降（P＜0.05），24h 时已接近正常对照组水平。槐定碱高、中、低剂量组在给予LPS后2 h 的TLR4蛋白表达均与正常对照组无统计学意义，至6h三个剂量组的TLR4蛋白表达均达高峰，但在12h时均已较LPS模型组提前下调至接近正常对照组水平，见图9、10。
2.6 血清中TNF-α含量
槐定碱三个剂量处理小鼠给予LPS后血清TNF-α水平均较同时间点LPS模型组显著降低（P＜0.01或P＜0.05），并在24h时均降至正常对照组水平。槐定碱三个剂量组之间下调血清TNF-α的效应差异无统计学意义，见图11。
3 讨论图书馆论文发表
本研究用槐定碱高（12mg/kg）、中（6mg/kg）、低（4mg/kg）三个剂量预防性给予急性内毒素血症肝损伤模型小鼠，动态观察各个时间点结果，均表明显著改善了模型小鼠的一般状况，减轻了肝组织病理损伤，显著降低血清ALT含量，其作用还呈现出一定的量-效关系。说明槐定碱具有阻断内毒素性肝脏炎症反应，减轻组织损伤的作用。
CD14、TLR4是细胞膜表面的LPS识别受体，LPS结合脂多糖结合蛋白(LBP)与mCD14后, 需借助跨膜的TLR4向胞内转导LPS信号。内毒素所致脓毒症主要是由于TLR4转导通路下游炎症因子的失控性释放，引起组织损伤和器官功能紊乱所致。因此目前认为CD14、TLR4是内毒素所致炎症反应发生的起步点，在炎症级联反应中具有类似于“阀门”样的作用［7-8］。调节内毒素信号转导最上游的关键分子，影响细胞对LPS的识别，使机体对LPS的炎症反应不至过强，可能成为有效防治脓毒症发生发展的重要方法。本研究结果表明槐定碱可下调肝组织CD14及TLR4的mRNA和蛋白表达，因而可减少LPS与CD14、TLR4的结合，抑制下游炎症因子表达，减轻内毒素的损伤效应。
TNF-α是公认的致炎细胞因子。已有报道脓毒症大鼠肝脏组织TLR4mRNA及TNF-αmRNA的表达呈显著正相关［9］,也就是说，TLR4 mRNA的表达增高,下游炎症因子TNF-α合成、分泌即增多，反之亦然。内毒素通过激活肝脏Kupffer细胞（KCs）释放大量TNF-α等炎性细胞因子，不但直接损害肝细胞，还使肝脏清除内毒素能力下降而加重内毒素血症，再促进TNF-α产生。TNF-α大量分泌再加重肝细胞损伤，并成为引起后续多器官损伤的重要环节。故本研究中选择检测血清中TNF-α作为指示槐定碱调节CD14、TLR4表达，影响下游炎症因子表达的指标。本研究中槐定碱三个剂量预防性给予模型小鼠在各个时间点都显著降低血清TNF-α水平（P＜0.01或P＜0.05），并在24h时均已达到正常对照组水平。此结果表明槐定碱下调肝组织CD14和TLR4表达与下调血清TNF-α含量的一致性，再结合上述槐定碱阻断内毒素性肝脏炎症反应，对内毒素血症小鼠的保护作用，说明槐定碱减轻内毒素性肝损伤的作用机制与其调节细胞表面LPS的模式识别受体CD14和TLR4的表达，并进而影响LPS的细胞内信号转导通路，抑制下游炎症因子表达有关。
当然除CD14和TLR4外，在LPS炎症信号转导通路上还有其它上游和下游受体及转导分子，各自都有固定的功能，槐定碱对它们的作用还有待于深入研究。
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