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ASPCR方法检测中国人群CYP2C19基因多态性

作者:时间:2011-02-10 16:15:09 来源:www.ksfbw.com 阅读次数:837次 ]

【摘要】目的：建立一种快速、灵敏的细胞色素氧化酶P450 2C19基因多态性检测方法。方法：分离外周血淋巴细胞基因组DNA，分别用一对等位基因特异性(allelespecific, AS)的反向引物与共用正向引物进行PCR扩增，通过电泳分析对应的PCR产物来判断CYP2C19基因型。在AS引物3′端倒数第三位或第二位引入错配碱基改进特异性。采用优化后方法对278例健康人进行CYP2C19基因型分析。结果：ASPCR可检测CYP2C19基因多态性，引入第二个错配碱基可提高检测特异性。经直接测序验证结果完全一致。结论：建立和优化的ASPCR方法适用于CYP2C19基因多态性快速检测。

【关键词】细胞色素氧化酶2C19；遗传多态性；基因型；等位基因特异性PCR

［ABSTRACT］ Objective: To develop a rapid and sensitive method for genotype analysis of the CYP2C19 gene in Chinese population. Methods: The genomic DNA was extracted from lymphocytes. A common forward primer and one of the two allelespecific (AS) reverse primers were used in parallel PCR reactions. The PCR products were analyzed by electrophoresis and specific amplification indicated the presence of the allele. In order to enhance the PCR specificity, the extra mismatch based at the third or second nucleotide position from the 3′end of AS primers were introduced. Results: Two hundred and seventyeight DNA samples were analyzed by this new method. The CYP2C19 genotyping results derived from this ASAPCR were perfectly consistent with sequencing. Conclusion: The new method developed and optimized in this study is a suitable strategy for CYP2C19 genotyping. It also enables accurate and rapid detection of CYP2C19 polymorphisms.

［KEY WORDS］ CYP2C19; Genetic polymorphism; Genotype; Allelespecific PCR

细胞色素氧化酶P450 2C19 (CYP2C19)是人体中重要的代谢酶。最初因催化S美芬妥英羟化代谢功能而被称为S美芬妥英羟化酶［1］, CYP2C19催化羟化、氧化及环化等反应，参与机体多种内源性及外源性化学物质的代谢。奥美拉唑、美芬妥英、安定、普萘洛尔等临床常用药物经CYP2C19代谢［2-4］，CYP2C19的功能与疾病风险及药物疗效都密切相关。

CYP2C19活性存在个体间差异，以S美芬妥英为探针药物，依据其代谢速度分为强代谢表型（Extensive Metabolism，EM）和弱代谢表型（Poor Metabolism，PM）。研究发现个体间代谢表型差异的重要原因是其基因多态性，外显子5上的第681位密码子G>A变异（c681G>A，称为“m1突变”）和外显子4上的第636位密码子G>A变异（c636G>A，称为“m2突变”）是引起PM表型的最主要基因变异。亚洲人群95%以上PM表型由m1和m2变异决定［5，6］。

分析CYP2C19基因多态性可推断代谢表型，从而预测解毒能力和患病风险，还可预测药物代谢能力、药物疗效及毒副作用，指导临床合理用药。本研究基于等位基因特异性PCR（allelespecific PCR，ASPCR）原理，建立了快速CYP2C19基因多态性检测方法，探索提高检测特异性的条件。并用所建立方法对健康人群CYP2C19基因多态性等位基因分布频率进行了初步分析。

1 材料与方法

1.1 基因组DNA提取

278例健康体检者，男性155例，女性123例，平均年龄41岁。新鲜采集外周静脉血，EDTA抗凝保存。采用基因组DNA提取试剂盒（天根生物技术公司），参照使用说明书操作，提取基因组DNA，-80℃保存备用。

1.2 引物设计

参照Genbank中CYP2C19基因序列（AY796203）和ASPCR原理［7］，采用OLIGO 6.0软件设计引物（图1）：针对每个变异位点设计一对等位基因特异性引物（AS引物），其3′末端分别与变异位点G或A碱基互补。M1ASRP1T和M1ASRP1C用于检测m1变异（c681G>A）；M2ASRP1T和M2ASRP1C用于检测m2变异（c636G>A）。为增加扩增特异性和检测分辨率，设计在3’端第3位(M1ASRP2T和M1ASRP2C)或第2位（M2ASRP2T和M2ASRP2C）引入错配碱基的ASPCR引物（表1）。同时为排除PCR反应系统敏感性所致基因型判断失误，在AS引物下游设计了参照引物M1RefRP和M2RefRP。上游共用引物与一种AS引物用作突变检测，含对应等位基因的模板中可扩增PCR产物，而不含对应等位基因的模板则不扩增。在所有标本中参照引物与正向引物共同扩增较大的片段，作为PCR的系统内参照。检测c636G>A的ASPCR产物为146bp，参照PCR产物为439bp；检测c681G>A的ASPCR产物为143bp，参照PCR产物为309bp。

图1 引物设计示意图

表1 ASPCR引物序列

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命名序列注释

M1ASFP5′ACAACCAGAGCTTGGCATATTGT3′
M1ASRP1T5′GGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCT3′
M1ASRP2T5′GGTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTGCT3′3′第三位错配
M1ASRP1C5′TTTTTA AGTAATTTGTTATGGGTTCCC3′
M1ASRP2C5′TTTTTA AGTAATTTGTTATGGGTTGCC3′3′第三位错配
M1RefRP5′CAATGAATCACAAATACGCAAGC3′
M2AS

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