褪黑素对Aβ诱导的大鼠脑组织GFAP和S100β蛋白表达的干预作用
【摘要】 目的 观察褪黑素(MT)干预β淀粉样蛋白(Aβ)诱导的大鼠脑组织胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S100β蛋白的表达，探讨MT对老年痴呆症(AD)治疗的作用机制。方法 30只大鼠随机分为生理盐水对照组、β淀粉样蛋白(Aβ)诱导AD模型构建组(模型组)和AD模型+MT治疗组(MT组)。动物喂养40 d时取大鼠脑组织，用HE染色观察脑组织病理变化，免疫组化染色法检测Aβ标记的脑组织部位以及Aβ对神经细胞毒性作用，同时检测胶质细胞的GFAP和S100β蛋白的表达水平。结果 HE染色观察脑组织病变在MT组明显轻于模型组;免疫组化结果显示，Aβ的表达水平在模型组和MT组二者间无明显差异，但Aβ对海马CA3区神经元损伤作用在模型组要大于MT组。GFAP和S100β表达水平在模型组则显著高于MT组和正常组(P<0.05)。结论 用MT干预治疗，可降低AD模型鼠胶质细胞表达GFAP和S100β蛋白的水平，从而起到了减轻大脑神经元细胞的损伤作用。
【关键词】 褪黑素; 老年痴呆症;β淀粉样蛋白;星形胶质细胞
阿尔茨海默病(AD)是一种常见的老年痴呆症，主要表现为认知能力丧失以及神经病理性结构损伤,包括脑组织萎缩、老年斑和神经纤维缠结与大量的β淀粉样蛋白(Aβ)沉积。AD是威胁老年群体健康与寿命的最重要的疾病之一〔1〕，目前尚无有效治疗方法，因此深入开展对AD发病机制研究和寻找有效治疗方法具有重要意义。研究证明年龄老化和脑组织中Aβ沉积是促使AD发生发展的主要原因，与机体氧自由基产生增加、清除氧自由基能力下降等因素有关〔2〕。神经胶质细胞构成中枢神经系统微环境，活化后可分泌大量细胞因子，释放氧自由基、激活补体，启动免疫反应，在AD的病变中起重要作用。褪黑素(MT)是一种重要的抗衰老激素，可有效地防止大脑功能退化，减少与年龄相关的炎症基因表达增长，并诱导抗氧化的基因生成;能通过血脑屏障，且价廉又无明显毒副作用〔3〕。考虑到MT具有巨大的潜在效应，故有可能成为一种极好的用于研究治疗AD疾病的化合物。本实验在观察Aβ所引起神经毒作用的同时，重点探索MT干预Aβ诱导大鼠脑组织表达GFAP和S100β两种蛋白水平的影响，以了解MT在Aβ沉积在脑组织所发挥的作用，为治疗AD提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 纤维型Aβ1～42的制备 取0.5 g Aβ1～42(美国Sigma公司)溶于250 μl注射用生理盐水中，用电动混悬器充分混匀，置于37℃恒温箱中孵育1 w，使其成为聚集状态的纤维型Aβ1～42,置4℃冰箱中备用。
1.2 动物分组及模型制备 成年SD雄性大鼠30只，体重180～220 g,由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供，其中随机取20只建立AD模型，10只作为正常对照组。建模方法：将SD大鼠用10%水合氯醛 (0.35 mg/kg)麻醉后置于立体定位仪上，切开皮肤，找到前囟所在位置，参考大鼠图谱确定前囟后3.0 mm，中线旁2.0 mm为海马的所在的体表投影位置，以牙科钻钻开一骨窗，将微量注射器固定在立体定位仪上，进针约2.8 mm，缓慢均匀注入纤维型Aβ1～42溶液10 μg/5 μl,5 min注射完毕，留针5 min，然后缓慢撤针，术后缝合皮肤。对照组按照模型制备的全过程在脑内注射生理盐水5 μ1。建模成功后随机分为模型组和MT用药组，与正常组均平行给予常规饮食及正常活动。模型组和对照组均灌胃1 ml生理盐水，MT用药组用褪黑素0.15 mg/kg(生理盐水配制)灌胃，每次1 ml/d，持续40 d。论文代理发表
1.3 脑组织切片的制备 模型建立40 d后，将对照组、MT组和模型组三组大鼠用10%水合氯醛(0.35 mg/kg)麻醉，暴露心脏，经左心室灌注0.01 mol/L PBS，待大鼠的肝脏颜色变浅，然后改以4%的多聚甲醛灌注，流速约为10 ml/min，并取脑组织置于4%多聚甲醛溶液中冰箱后固定过夜，次日用0.01 mol/L PBS反复浸洗，最后将脑组织梯度酒精脱水，透明，石蜡包埋，冠状切片(厚约5 μm)备用。
1.4 免疫组织化学主要试剂和实验方法 取脱蜡切片入PBS缓冲液，经抗原修复液(美国Vector，H3300)80℃存放20 min，待自然冷却后，缓冲液清洗2次，再入3% H2O2室温下5 min，以消除内源性过氧化物酶。然后，切片孵育在2%小牛血清中1 h，以减少组织非特异性反应。实验中所用抗体6E10购于美国Covance 公司(产品编号：SIG39340，1∶1 000);NeuN购于Chemicon公司(产品编号：MAB377，1∶1 000);S100β购于Sigma，产品编号：S2657，1∶100),GFAP购于美国DAKO公司(Z0334，1∶1 000)。切片分别在 1%小牛血清与0.1% Triton和上述抗体的混合液中4℃冰箱孵育过夜，次日经缓冲液洗涤3次后,加相应二抗(1∶400)溶液，室温孵育1 h，缓冲液洗涤3次后，加生物素与卵白素结合(ABC)试剂盒配置的混合液中再孵育1 h。底物呈色反应采用DAB试剂盒。所有二抗、ABC和DAB试剂盒均购自美国Vector公司。呈色反应后，切片经逐级脱水并用加拿大中性树胶封片。
1.5 图像采集及统计学分析 在日本产Nikon Eclipse 80i显微镜下观察结果，并用Nikon DS高分辨率数码相机经NISElements AR 3.0软件拍照。对脑组织切片均通过拍照收集皮质和海马切面图像。结果分析，采用Ver.3.00程序软件作图像数字采集及半定量分析。结果评估采用单一方差分析，Excel软件统计制表。
2 结 果
2.1 Aβ在模型组和MT组脑组织的表达 6E10(Aβ1～16)抗体标记脑组织的溶解或聚集状态Aβ。显微镜下观察在对照组未发现Aβ的沉积，而模型组和MT组可见海马中央以及皮质中线旁2 mm处可见有大小不等分布不均的6E10抗体阳性反应物表达，两组比较没有明显的差异,见图1。
2.2 MT对Aβ的神经细胞毒性影响 在模型组和MT组的Aβ注射的脑组织皮质区和海马CA3区可见神经细胞大小不一，部分神经细胞萎缩变形，神经细胞带受损，细胞数量减少，对照组未发现上述改变，见图2。发表论文网
图1 Aβ在各组脑组织的表达(DAB，×100)图2 MT对Aβ的神经细胞毒性影响(DAB，×400)
2.3 各组大鼠脑组织GFAP与S100β蛋白的表达 GFAP和S100β蛋白在各组大鼠脑组织均有表达，GFAP在对照组的阳性反应细胞数量较少，细胞染色较浅，MT和模型组两种蛋白的阳性反应细胞增多，染色反应增强，脑组织海马和皮质部位均有明显的表达，两组反应与对照组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1,图3，图4。表1 各组大鼠脑组织中6E10、GFAP和S100 β表达(x±s)
3 讨 论
已知脑内发挥神经毒作用的Aβ主要是Aβ1～40和Aβ1～42。虽然实验用Aβ是人工合成，但不少研究证明它几乎和内生性的Aβ1～42有同等毒性作用，以聚集状态的Aβ诱导的神经元退行性病变与AD的病理改变十分相似〔4〕。本实验通过以纤维型Aβ进行大鼠背侧细胞带微量注射，Aβ1～42以不溶解状态成大分子而不被吸收，用免疫组织化学的方法用6E10抗体反应证实Aβ存在模型鼠大脑皮质
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