反义寡核苷酸抑制人恶性黑素瘤A375细胞survivin mRNA及其蛋白的表达

【摘要】  　　目的 研究survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人恶性黑素瘤A375细胞survivin mRNA及蛋白表达的影响。方法 人工合成survivin ASODN，脂质体介导转染人恶性黑素瘤细胞株A375，采用原位杂交、免疫组化SP法检测survivin mRNA及其蛋白表达的变化。结果 转染24 h后，ASODN组A375细胞survivin mRNA表达较对照组显著下调(P<0.01)；转染48 h后，与对照组相比，ASODN组细胞的survivin蛋白水平显著下降(P<0.01)。结论 Survivin ASODN可下调A375细胞survivin mRNA的表达和survivin蛋白水平。

【关键词】  survivin 恶性黑色素瘤 反义寡核苷酸

　　ABSTRACT: Objective  To study the effects of survivin antisense oligodexynucleotide (ASODN) on the expression of survivin mRNA and its protein in human malignant melanoma cell line A375. Methods  Survivin ASODN was synthesized and transfected into melanoma cell line A375 by the liposome-encapsulation. Survivin mRNA and protein were detected by in situ hybridization and immunohistochemistry, respectively. Results  At 24h after the transfection, the expression of survivin mRNA was significantly lower in the ASODN group than in the control group (P<0.01). The expression of survivin protein was also significantly decreased in the ASODN group than in the control group at 48h after transfection (P<0.01). Conclusion  Survivin ASODN can down-regulate the expression of survivin mRNA and its protein in A375 cells.

　　KEY WORDS: survivin; malignant melanoma; antisense oligonucleotide

　　Survivin是新近发现的一种结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein, IAP)，表达于人类大多数肿瘤组织，但是在正常成人组织不表达(胸腺除外)［1］，与肿瘤发生、发展及治疗抵抗密切相关。在恶性黑素瘤皮损［2］及其细胞株中［3］都存在survivin过表达。本研究以survivin反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASODN)转染体外培养的恶性黑素瘤细胞株A375，分别用原位杂交和免疫组化的方法检测人恶性黑素瘤细胞survivin mRNA表达及其蛋白水平的变化，初步探讨反义寡核苷酸的作用机制，为survivin ASODN治疗恶性黑素瘤提供理论依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料 学术论文发表

　　人恶性黑素瘤细胞株A375购于第四军医大学口腔生物学教研室；Oligofectamine转染试剂购自Invitrogen公司；Survivin原位杂交检测试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物公司；羊抗人survivin多克隆抗体sc-8806购自Santa Cruz公司；SP免疫组织化学试剂盒购自中山生物公司。

　　1.2  全硫代寡核苷酸设计、合成和修饰

　　Survivin反义寡核苷酸序列设计参照文献［4］，由18个碱基组成，序列如下：5＇-TGTGCTATTCTGTGAATT-3＇。寡核苷酸的合成及全硫代磷酸化修饰均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

　　1.3  细胞培养

　　复苏人源性恶性黑素瘤细胞株A375，用含10 mL/L胎牛血清RPMI-1640培养基培养，2-3 d传代一次。

　　1.4  原位杂交测定survivin mRNA

　　将无菌盖玻片放入24孔培养板，以4×104 /mL浓度接种细胞，6 h后各孔分别置换为不含血清的、含ASODN的试验用培养液0.66 mL。ASODN的处理浓度设为20 μmol/L，脂质体终浓度为1 mL/L。实验分ASODN处理组和空白对照组：①ASODN处理组，即试验用培养液含20 μmol/L ASODN；②空白对照组，即不含血清的RPMI-1640培养液。在无血清条件下阻断4 h后，各孔均加入含30 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养液0.34 mL，继续培养24 h后，倾出培养液，40 g/L多聚甲醛固定，按试剂盒程序进行原位杂交检测。每组测定3张切片，使用HPIAS-1000彩色病理图文分析系统，随机选取每张细胞片中不相重叠的400倍视野，共计数50个细胞，进行细胞阳性程度的测定，计算每组阳性细胞的平均染色灰度值，以确定细胞中survivin mRNA的相对含量。

　　1.5  免疫组化测定survivin蛋白的水平

　　细胞接种、分组和处理方法同原位杂交。进行4 h无血清阻断，再培养48 h后，倾出培养液，冷丙酮固定，免疫组化按试剂盒程序进行。取未经复染的免疫组化染色结果进行图像分析，利用HPIAS-1000彩色病理图文分析系统，分析转染前后人恶性黑色素瘤细胞中survivin蛋白表达的相对含量，每组选取3张切片，每张切片随机选择5个高倍镜测量视野，计数50个细胞，由计算机给出平均光吸收数值。

　　1.6  统计学处理

　　数据均采用平均数加减标准差表示。应用t检验进行统计分析，显著性差异取P<0.05。

　2  结 果

　　2.1  Survivin ASODN下调A375细胞survivin mRNA的表达

　　光镜显示对照组阳性细胞杂交信号位于胞浆，呈颗粒状，棕黄色(图1)。ASODN处理组胞浆中杂交信号与对照组比较明显减弱(图2)。说明转染ASODN后细胞survivin mRNA的翻译受到抑制。阴性对照结果均为阴性。用图像分析系统对阳性染色的强度(灰度值)进行半定量测定，灰度值与阳性强度成反比，灰度值越小，染色越强。两组细胞所测结果如表1所示。对照组平均灰度值为109.8±12.8，而ASODN处理组为188.6±8.2，两组经独立样本t检验显示差异有统计学意义(P<0.001)。表1  各组A375细胞survivin 原位杂交染色图像分析的灰度值（略）

　　2.2  Survivin ASODN降低A375细胞survivin蛋白表达的水平
 
　　免疫组化染色显示A375细胞survivin蛋白免疫阳性反应呈棕黄色，主要分布于胞浆。正常对照组阳性细胞染色较深(图3)。而s